Mechanisms of survival and maintenance of Hematopoietic Stem Cells and Multipotent Progenitor Cells

• Hematopoietic stem cells and progenitor cells are maintained in the bone marrow microenvironment, where factors including soluble and membrane-bound cytokines influence the processes of self-renewal, proliferation and differentiation. Two nonreduntant cytokines with effects on hematopoiesis, Kit Ligand (KL) and Flt3 Ligand (FL), signal via related tyrosine kinase receptors, c-kit and Flt3. In this thesis, we have studied which signaling pathways that are activated by these cytokines and are important for survival. We have shown that the serine-threonine kinase PKB (also known as Akt) is activated by both cytokines, but the upstream target PI-3 kinase is only necessary for the survival induced by KL and not FL. Also, KL could not prevent apoptosis in cells overexpressing a dominant negative form of PKB. The forkhead transcription factor FoxO3, which is phosphorylated and inactivated by PKB, was further shown to be of central significance for KL-mediated survival. The survival signals mediated by FL was shown to include antiapoptotic Bcl-2 family proteins. When overexpressed in progenitor cell lines, Bcl-2 was more effective in blocking apoptosis than PKB. Although both Bcl-2 and PKB could prevent a decrease in the mitochondrial membrane potential, Bcl-2 was superior with this respect. Some enhancement in survival was also seen when both proteins were overexpressed simultaneously. Finally, we studied the survival of bone marrow-derived multipotent hematopoietic progenitors in the presence of low levels of oxygen, hypoxia. We showed that survival was enhanced by hypoxia and improved the expansion of primitive colony forming cells.

• Popular Abstract in Swedish Homeostasen, dvs. bibehållandet av ett konstant antal blodceller, pågår genom hela livet och har sitt urprung från en sällsynt cell som huvudsakligen finns i benmärgen, där den utgör mindre än 1 cell på 10000-100000. Denna cell, den hematopoetiska stamcellen, ger upphov till alla blodprogenitorer (snabbväxande celler som har bestämt vilken typ av blodceller som de kan utvecklas till) genom differentiering (förändring av cellens egenskaper genom utmognad), samtidigt som den kan fylla på poolen av stamceller på nytt. I en människa som väger 70 kg ersätts varje dag nästan 1 biljon (1012) celler i det hematopoetiska systemet och ett viktigt mål med denna avhandling var att kartlägga hur olika faktorer (tex. cytokiner) påverkar stamcellernas celldelning, differentiering och överlevnad. Vi ville även finna de molekylära mekanismerna bakom blodstamcellers och blodprogenitorers överlevnad, vilka fortfarande är ofullständigt kända. Vi har framför allt undersökt två hematopoetiskt aktiva cytokiner; stamcellsfaktorn (KL) resp. Flt3-liganden (FL), vilka utövar en signalöverförande förmåga via tyrosinkinasreceptorer (c-kit resp. Flt3-receptorn). Dessa receptorer uttrycks på flera typer av blodceller och har föreslagits vara viktiga vid blodstamcellernas överlevnad och bibehållande. Detta understryks av att c-kit uttrycks på de mest odifferentierade blodstamcellerna, vilka har visat sig kunna nybilda alla celler i blodsystemet vid benmärgstransplantationer. Med avseende på FL-medierad överlevnad finns ytterst få rapporter, men överlevnadsproteiner från Bcl-2-familjen har föreslagits vara involverade, medan överlevnad förmedlad via c-kit tycks vara beroende av vilken typ av hematopoetisk cell som har undersökts. Vi har visat att KL förbättrar överlevnaden av hematopoetiska celler, men att KL inte aktiverar något protein från Bcl-2-familjen. Däremot uppreglerar FL Bcl-2-proteiner, vilket innebär att dessa för blodstamceller två centrala cytokiner tycks aktivera olika vägar för överlevnad. Med hjälp av blockerare för olika signalvägar identifierade vi ett viktigt protein för c-kit-förmedlad överlevnad av blodstamceller, nämligen PI-3 kinas. Nedströms från PI-3 kinas visade sig KL kunna aktivera protein kinaset Akt/PKB, vilkets funktion var nödvändigt för de hematopoetiska cellernas överlevnad. Akt/PKB har vidare visat sig inaktivera den genaktiverande forkhead faktorn FoxO3 och överuttryck av denna faktor visade sig kunna blockera KL-medierad överlevnad. Vidare studerade vi kombinationer av överuttryck av Akt/PKB och Bcl-2 i blodprogenitorer för att se om överlevnaden kunde förbättras ytterligare. Bcl-2 visade sig vara bättre på att bibehålla cellerna än Akt/PKB och en kombination av överuttryck av Bcl-2 och tillsats av KL gav en bättre överlevnad än överuttryck av Bcl-2 tillsammans med Akt/PKB. Detta tyder på att andra signalvägar nedströms från c-kit än Akt/PKB är viktiga i dessa celler. Det återstår dock att visa hur de mer odifferentierade blodstamcellerna skulle påverkas. I benmärgen hos möss har det visats att snabbt växande differentierade progenitorceller är lokaliserade nära blodkärlen, medan mer omogna blodstamcellerna är belägna i områden med lägre syretryck (hypoxi) än normalt (normoxi). Hypoxin har också visat sig vara en komponent av den hematopoietiska mikromiljön och en regulator av balansen mellan viloläge och tillväxt. Vad som gjorde detta speciellt intressant för oss var att hypoxi har visat sig kunna aktivera Akt/PKB i vissa celler. Initialt visade vi att progenitorceller odlade i närvaro av KL har en ökad överlevnad under hypoxi jämfört med normoxi. Vi fortsatte därför med att undersöka celler tagna direkt från benmärg. Vi fann att hypoxi gynnar en bibehållning och en eventuell förökning av blodstamceller, medan progenitorcellerna minskade i antal. Detta fynd skulle kunna vara viktigt kliniskt med avseende på hur man odlar celler vid benmärgstransplantationer. Ny kunskap kring mekanismerna vid hematopoetiska stam- och progenitorcellers tillväxt, val av differentiering och överlevnad kommer avsevärt att förbättra möjligheten att påverka stamceller till förlängd tillväxt ex vivo och på sikt leda till förfinade benmärgstransplantationer och till stamcellsbaserad genterapi. Eftersom blodcancer ofta uppstår på grund av genförändringar i de hematopoetiska stamcellerna kan våra resultat även leda till en bättre förståelse av de biologiska aspekterna på dessa förändringar.

Ämnesord

MEDICIN OCH HÄLSOVETENSKAP  -- Klinisk medicin -- Cancer och onkologi (hsv//swe)

MEDICAL AND HEALTH SCIENCES  -- Clinical Medicine -- Cancer and Oncology (hsv//eng)

Nyckelord

extracellulära vätskor

Hematologi

extracellular fluids

Haematology

hypoxia.

forkhead

Akt/PKB

Bcl-2

apoptosis

Flt3

FL

c-kit

KL

cytokines

Hematopoiesis

progenitor

Publikations- och innehållstyp

dok (ämneskategori)

vet (ämneskategori)