MORAXELLA CATARRHALIS OUTER MEMBRANE PROTEINS AND INTERACTIONS WITH THE HUMAN IMMUNE SYSTEM

• Moraxella catarrhalis is frequently colonizing the human respiratory tract, particularly in children. This gram-negative bacterium has during the last two decades been recognized as a pathogen causing otitis media in children and lower respiratory tract infections in adults with predisposing conditions such as chronic obstructive pulmonary disease (COPD). The virulence determinants of M. catarrhalis are believed to be the lipooligosaccharide and the outer membrane proteins. Three important outer membrane proteins are Moraxella IgD-binding protein (MID), the ubiquitous surface proteins (Usp) A1 and A2. MID is an adhesin and it binds to IgD in a non-immune manner. We show that the mid gene was highly conserved, and that the MID expression varied without relation to the anatomical site of isolation or geographical origin of the isolates. The expression was also shown to be controlled by a poly(G)tract downstream of the startcodon. The region of MID with essentially preserved IgD-binding was determined to be located between the amino acid residues 962-1200 and was designated MID962-1200. MID962-1200 was shown to be a tetramer in native conditions and interestingly, this tetrameric form bound IgD 23-fold more efficiently than the monomeric form. Moreover, MID962-1200 stimulated purified B cells to proliferate independently of T cells. However, addition of IL-4 or IL-2 was required for efficient proliferation. We have also shown that M. catarrhalis interferes with both the classical and the alternative pathway of the complement system. It bound to the fluid phase inhibitor C4b-binding protein (C4BP) and the binding was mediated through UspA1 and UspA2. Importantly, C4BP retained its activity when bound to the surface of M. catarrhalis and was thus able to inhibit the activation through the classical pathway. We also showed that M. catarrhalis have the capacity to absorb C3 from serum independently of complement activation and UspA2 was determined to be the major binder of C3. In summary, MID is widely distributed among different M. catarrhalis strains. The IgD-binding region of MID is located between the amino acid residues 962-1200 and stimulates B cells independently of T cells. Finally, the M. catarrhalis outer membrane proteins UspA1 and UspA2 interfere with the complement system by binding C4BP and C3.

• Popular Abstract in Swedish Moraxella catarrhalis är en bakterie som man länge trodde var en del av vår normala bakterieflora och därmed ofarlig. Under de senaste tjugo åren har M. catarrhalis dock visat sig vara en av orsakerna till öroninflammation hos barn och lägre luftvägsinfektioner hos vuxna med någon annan underliggande sjukdom som t.ex. kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL). De senaste 10 åren har mer än 90 % av M. catarrhalis blivit resistenta mot våra vanligaste antibiotika preparat. Detta har bidragit till att forskningsintresset för bakterien ökat med mål att finna lämpliga proteiner för vaccinframställning. På bakteriens yta finns proteiner vilka bl.a. används till att få tag i näring, fästa vid värden och skydda sig mot värdens försvarsmekanismer. Dessa yttermembranproteiner är ofta inblandade när en inflammation uppstår och är därför intressanta att undersöka för att skapa sig en bild av hur bakterien orsakar sjukdom. Jag har i mitt doktorandprojekt arbetat med tre av M. catarrhalis yttermembranproteiner; MID (Moraxella Immunoglobulin D-bindande protein), Usp (Ubiquitous [allmännt utbrett] surface protein) A1 och UspA2. Eftersom MID är en trolig komponent i ett eventuellt framtida vaccin mot M. catarrhalis är det nödvändigt ta reda på så mycket som möjligt om hur proteinet är uppbyggt och hur det interagerar med människan och vårt immunsystem. I artikel I visar vi att genen som kodar för MID finns i alla de 98 stammar som vi undersökt och att variationerna mellan stammarna är mycket små. Vi kunde även klargöra att produktionen av MID styrs av en upprepad sekvens (poly(G)box) i början av genen. Viktiga egenskaper hos MID är att den fungerar som ett adhesin som hjälper bakterien att fästa till värden (människan). Dessutom har det tidigare visats på vår avdelning att MID binder till humant immunoglobulin D (IgD). IgD är en av fem olika typer av antikroppar, vilkas uppgift är att känna igen främmande ämnen (antigen) som kommer in i kroppen och bidra till dess eliminering. IgD sitter på ytan av en av vårt immunsystems nyckelceller, B-lymfocyten, där den binder till antigen så att cellen kan ta upp det. Detta kan sedan resultera i produktion av stora mängder specifika antikroppar mot antigenet. Vi har identifierat den IgD-bindande delen av MID (artikel II) och namngett den MID962-1200. Därtill har vi upptäckt att strukturen hos MID962-1200 är avgörande för optimal binding till IgD. I artikel III visar vi att MID962-1200 både kan binda till B-lymfocyter och stimulera B-lymfocyterna till att börja dela sig. För aktivering av B-lymfocyter krävs oftast förutom bindning till ett antigen även en interaktion med en annan viktig cell i vårt immunsystem som benämns T-lymfocyten. Vi fann att MID962-1200 kan aktivera B-lymfocyter oberoende av direkt kontakt med T-lymfocyter. Däremot krävdes det andra faktorer för god aktivering av B-lymfocyterna. Att karakterisera MID962-1200 är viktigt av flera anledningar. MID962-1200 skulle kunna användas som ett verktyg för att studera IgD-receptorn och och dess signaleringsvägar i B-lymfocyten. Dessutom hade det varit intressant att undersöka om MID962-1200 skulle kunna användas som en bärarmolekyl för andra antigen och därmed presentera dessa för B-lymfocyterna. Två andra yttermembranproteiner hos M. catarrhalis är UspA1 och UspA2. Sedan några år tillbaka vet man att UspA2 är involverat i M. catarrhalis serumresistens. I människans serum finns en mängd proteiner som samarbetar till att döda bakterier och andra mikrober genom att göra hål i deras cellmembran (lysering). Denna proteinkaskad kallas med ett gemensamt namn för komplementsystemet. Serumresistens innebär att bakterien har en förmåga att undvika att lyseras av människans serum, d.v.s. komplementsystemet. Eftersom komplementsystemet skulle kunna skada våra egna celler om det inte kontrollerades noga så ingår en rad proteiner vars uppgift är att reglera systemets aktivitetet. Ett av dessa regulatoriska proteiner kallas C4BP (C4b-bindande protein) och i artikel IV visar vi att M. catarrhalis binder till detta protein via yttermembranproteinerna UspA1 och UspA2. Detta visade vi genom att konstruera M. catarrhalis mutanter som saknade UspA1 och/ eller UspA2 på ytan (UspA1/ A2 mutanter). Vi upptäckte dessutom att C4BP kunde blockera komplementet även när det var bundet till M. catarrhalis yta. Utifrån dessa resultat drog vi slutsatsen att M. catarrhalis sannolikt använder C4BP för att skydda sig mot serumets bakteriedödande effekter. Komplementsystemet kan aktiveras på tre olika sätt och C4BP kan bara skydda bakterien genom att blockera en av aktiveringsvägarna, den klassiska vägen. Därför var det av yttersta intresse att studera om även en av de andra aktiveringsvägarna, den alternativa vägen, kunde blockeras. Vi fann att UspA2 inte bara binder till C4BP utan även till C3 som är en nyckelmolekyl i komplementkaskaden (artikel V). Uppgiften för C3 är normalt sett att binda till bakterier vilket får följden att bakterien lyseras. Vi visar att bindningen mellan UspA2 och C3 sker på ett sätt som inte gagnar komplementsystemet utan snarare bakterien. Detta resulterade i att komplementet inte kunde lysera M. catarrhalis i samma utsträckning. Sammanfattningsvis presenteras i denna avhandling utbredning och reglering av yttermembranproteinet MID samt karaktärisering av den IgD-bindande delen hos MID. Slutligen beskrivs två mekanismer som används av M. catarrhalis som skydd mot humant serum.

Ämnesord

MEDICIN OCH HÄLSOVETENSKAP  -- Medicinska och farmaceutiska grundvetenskaper -- Mikrobiologi inom det medicinska området (hsv//swe)

MEDICAL AND HEALTH SCIENCES  -- Basic Medicine -- Microbiology in the medical area (hsv//eng)

Nyckelord

mycology

Mikrobiologi

virology

Microbiology

C4BP

B-cells

UspA2

Moraxella catarrhalis

virologi

mykologi

bakteriologi

bacteriology

C3

IgD

Moraxella IgD-bindning protein

UspA1

Publikations- och innehållstyp

dok (ämneskategori)

vet (ämneskategori)