On the Regulation of Ornithine Decarboxylase

• The polyamines putrescine, spermidine and spermine have been shown to be involved in cell growth and differentiation, and are considered to be crucial components of the living cell. The synthesis of polyamines in the cell is strictly regulated. The first and rate-limiting step in the biosynthesis of polyamines is catalysed by the enzyme ornithine decarboxylase (ODC). Mammalian ODC has a very fast turnover, and is highly regulated at several levels, including translational mechanisms. Translational control of ODC has been shown to be important in the polyamine-mediated feedback regulation, as well as in the hypotonic induction of the enzyme. This control has been suggested to be dependent on the very long 5' and 3' untranslated regions of ODC mRNA. In the present thesis, the importance of these mRNA regions in the translational regulation of ODC exerted by polyamines or occurring after hypotonic shock were studied. A series of ODC cDNA constructs with various truncations in the 5' UTR, coding region and 3' UTR were used. These constructs were expressed in different cellular expression systems, and the effects of polyamines and hypotonicity, respectively, were analysed. The results showed that the polyamine-mediated regulation of ODC synthesis was neither affected by the 5' UTR nor the 3' UTR of the ODC mRNA, but instead appeared to be dependent on the ODC mRNA sequence coding for the C-terminal degradation domain of the enzyme. The hypotonic induction of ODC, on the other hand, was highly dependent on the 3' UTR, but not on the 5' UTR, which demonstrates the first more specific role for the 3' UTR in the regulation of ODC. This also indicates that the mechanisms by which hypotonicity and polyamines affect the translation of ODC mRNA are unrelated. In order to gain more knowledge about the mechanisms involved in the regulation of ODC, the ODC gene from the trypanosomal parasite Crithidia fasciculata, which is not subjected to polyamine-mediated feedback regulation of ODC, was cloned and characterised. C. fasciculata ODC was found to lack the sequence corresponding to the degradation domain of mammalian ODC, although it is a metabolically unstable protein even when expressed in mammalian cells, suggesting that C. fasciculata ODC contains other signals important for the rapid degradation of the enzyme.

• Popular Abstract in Swedish Polyaminer finns i alla levande celler, såväl i bakterier som i växter, djur och människor, och utgör en mycket viktig beståndsdel i dessa. Utan dessa polyaminer kan inte cellerna växa och dela sig. Polyaminerna putrescin, spermidin och spermin bildas i cellen från aminosyran ornitin. Till sin hjälp för denna bildning har cellerna ett enzym vid namn ornitindekarboxylas (ODC), som styr bildningen av den första polyaminen, putrescin. Ornitin -------> Putrescin -------> Spermidin -------> Spermin Kemiskt sett är polyaminerna ganska enkelt uppbyggda. De består av en kolvätekedja som innehåller två (putrescin), tre (spermidin) respektive fyra (spermin) kvävegrupper. Det som är lite speciellt med polyaminerna är att de är positivt laddade vid kroppens normala pH, och därför kan binda till, och påverka, negativt laddade molekyler inuti cellen, såsom till exempel cellens arvsmassa (DNA). Alla celler är därför beroende av ett noggrant reglersystem för att hålla halterna av polyaminer på en lagom nivå. Om det av någon anledning bildas för lite polyaminer förlorar cellen ganska snabbt sin normala funktion, slutar att dela sig och, i vissa fall, dör. Om det å andra sidan skulle bildas för mycket polyaminer kan detta vara direkt giftigt för cellen, eller leda till att cellen omvandlas från en normal cell till en cancercell. Trots att polyaminforskningen har en lång historia och ett stort antal vetenskapliga artiklar bakom sig, är polyaminernas mer exakta funktioner i stort sett helt okända. Det faktum att celler kan fås att sluta växa och dela sig när man hämmar cellens bildning av polyaminer, har dock gjort att intresset för hur bildningen av dessa ämnen regleras i cellen har vuxit. På sikt skulle sådana kunskaper kunna ge värdefull information om till exempel cancerutveckling och olika möjligheter till behandling av sjukdomar där snabb celldelning är ett problem. Bildningen av polyaminer i cellen kan styras på flera olika sätt. Flera experiment har bl a visat att polyaminerna på något sätt styr sin egen bildning. Om man ger cellerna extra polyaminer, minskar aktiviteten hos enzymet ODC, och det kommer följaktligen att bildas mindre mängd polyaminer tills dess att balansen är återställd. Om man å andra sidan tömmer cellerna på polyaminer ökar aktiviteten hos ODC, varvid det bildas mer polyaminer igen. På detta sätt lyckas cellerna hålla en för respektive cell optimal nivå av polyaminer. Exakt hur polyaminerna påverkar ODC är dock fortfarande okänt. Mitt avhandlingsarbete har huvudsakligen gått ut på att mer i detalj studera vilka mekanismer som styr regleringen av ODC. Man har tidigare funderat över om polyaminerna kanske kan påverka strukturen hos de budbärarmolekyler (mRNA), som från cellens DNA överför mallen för enzymet ODC. Därmed skulle mRNAt fungera sämre som mall, och mindre mängd ODC bildas. Genom att förändra utseendet hos ODC-mRNAt, och låta detta få sitt uttryck i tumörceller odlade i cellodlingsflaskor, har vi försökt lista ut vilken del av ODC-mRNAt som är viktig för att polyaminernas reglerande funktion skall kunna äga rum. I de första delarbetena i avhandlingen (I,II,III,IV) har vi lyckats visa att de ovanligt långa icke-kodande delarna 5'-UTR och 3'-UTR av ODC-mRNAt (d v s de avsnitt av mRNAt som inte används för ODC-tillverkning), som tidigare har föreslagits vara viktiga, är utan betydelse för polyaminernas förmåga att styra tillverkningen av ODC. Vi har också lyckats visa att en av dessa delar, 3'-UTR, däremot tycks ha en viktig funktion vid ett annat tillstånd, nämligen då celler utsätts för ett utspätt cellodlingsmedium (hypoton behandling). Vid en sådan behandling ökar normalt cellens mängd av ODC, men i fallet då 3'-UTR saknas, saknas även denna ökning av ODC. Detta är första gången man har kunnat påvisa en mer specifik funktion för ODC-mRNAts 3'-UTR i regleringen av ODC. Det sista delarbetet (V) i avhandlingen handlar om isoleringen och karakteriseringen av ODC-genen från parasiten Crithidia fasciculata. C. fasciculata är en släkting till den mer välkända sjukdomsframkallande parasiten Trypanosoma brucei. T. brucei sprids med tsetseflugan och orsakar afrikansk sömnsjuka, en sjukdom som skördar cirka 300 000 liv om året. C. fasciculata smittar dock inte människor, och används därför ofta som modellorganism för den sjukdomsframkallande parasiten. Till skillnad från ODC i däggdjur, påverkas inte T. brucei- och C. fasciculata-ODC av polyaminer. Det var därför intressant att undersöka hur genen för ODC i C. fasciculata skiljer sig från ODC-genen i däggdjursceller. Vid sekvensbestämning av ODC-genen i C. fasciculata fann vi att denna var ganska skild från den hos däggdjur. C. fasciculata-ODC verkar vara mycket större än däggdjurs-ODC. Dessutom saknar C. fasciculata-ODC den del av enzymet som hos däggdjur visat sig vara absolut nödvändig för den snabba biologiska omsättningen av ODC, detta trots att även C. fasciculata-ODC har snabb omsättning i cellen. Det sistnämnda fyndet tyder på att det finns andra delar av ODC som är viktiga för omsättningen av enzymet i C. fasciculata.

Ämnesord

NATURVETENSKAP  -- Biologi -- Utvecklingsbiologi (hsv//swe)

NATURAL SCIENCES  -- Biological Sciences -- Developmental Biology (hsv//eng)

Nyckelord

Fysiologi

Physiology

Crithidia fasciculata.

polyamines

Ornithine decarboxylase

translational control

osmolarity

untranslated region

COS cells

CHO cells

transfection

protein turnover

PEST region

Publikations- och innehållstyp

dok (ämneskategori)

vet (ämneskategori)