Calcium-dependent Affinity Domains for the Purification of Antibodies and Antibody Fragments

• Antibodies are essential proteins in both our bodies and biotechnological research, and hold outstanding therapeutic value. The market for antibody-based therapeutics has grown exponentially during the last decades, owing to several advantages over small molecule drugs, such as fewer undesirable side effects associated with a higher target specificity. To keep up with the increasing amounts of antibodies that are on demand, emphasis has been on the optimization of upstream processes for antibody production while the advances in downstream processing and the purification of antibodies have been limited. In the downstream process, the gold standard for the primary capture step is Protein A affinity chromatography. However, elution of the antibodies from the Protein A ligand is accomplished at a low pH, which can lead to antibody aggregation and impaired biological activity. The purification procedure therefore hinders the development of new antibodies that are acid-sensitive, despite promising therapeutic potential, and may pose a threat to the increasingly popular bispecific antibodies that tend to be more aggregation prone. Further, acidic elution conditions may be an even bigger concern in the purification of antibody fragments, which also represent promising therapeutic candidates, providing several advantages over full-length antibodies in certain applications.The work in this thesis aimed to enable the purification of a more diverse group of antibodies and antibody fragments, regardless of their stability in a highly acidic environment. Efforts were also made to reduce the high antibody manufacturing costs to make these antibody therapeutics more easily accessible to patients. In order to elute the antibodies in the Protein A capture step under milder conditions, the protein ligand ZCa was developed. ZCa was isolated from a phage display library based on a Protein A domain with a grafted calcium-binding loop, and permits the calcium-dependent elution of antibodies at close to neutral pH by adding sodium chloride. The domain provides the foundation for this thesis, and was extensively optimized to achieve a high-capacity resin and an inexpensive purification strategy, yielding exceptional recoveries of pure antibody. Most importantly, ZCa was able to entirely prevent the formation of aggregates of an antibody through mild elution. Moreover, the optimized ZCa resin was applied in an integrated continuous biomanufacturing process, designed to entirely avoid the use of low pH. The implementation of the process at pilot scale for 17 days demonstrated the robustness of the novel resin along with many other promising process attributes. High productivity and yields were obtained in addition to negligible aggregate formation and low levels of residual DNA and host cell proteins, comparable to established processes.Finally, this thesis presents a combinatorial library for calcium-regulated affinity constructed from ZCa, from which numerous binders with novel target specificities were isolated. The calcium-dependent binders to single chain variable fragments (scFvs) could be used to selectively capture and elute scFv at neutral pH. Binding analysis and optimization efforts indicated potential as a platform approach for the mild and efficient purification of different scFvs.In conclusion, the purification strategies proposed in this thesis considerably improve the purification of antibodies and scFvs, and may encourage the future innovation of a wider range of antibody-based therapeutics. The continuous process supports the applicability of ZCa in a state-of-the-art commercial manufacturing process, and contributes to the more efficient manufacturing of antibodies, which can make them more affordable and accessible to the patients in need.

• Denna avhandling grundar sig i proteiner, vilka är nödvändiga för vår överlevnad och alla former av liv. De är involverade i nästintill alla processer i kroppen och gör allt från att transportera syre till att bryta ner maten vi äter. Ett av de mest välkända proteinerna är antikroppen, som bär på den tunga uppgiften att skydda oss från smittämnen såsom bakterier och virus, som en del av vårt immunförsvar. Vi kan bilda antikroppar mot i stort sett vilka inkräktare som helst, vilket leder till att andra delar av immunförsvaret i sin tur kan förstöra smittämnet. Förmågan att skapa antikroppar som binder starkt till många olika molekyler på dessa smittämnen har utnyttjats inom bland annat medicinsk forskning. Många av de så kallade biologiska läkemedlen utgörs av antikroppar eller fragment av antikroppar, vilka erbjuder många fördelar gentemot traditionella syntetiska läkemedel. Ett exempel är färre oönskade biverkningar på grund av mer målinriktade specifika interaktioner. Marknaden för dessa biologiska läkemedel är ständigt växande, men är emellertid begränsad av betydligt mer kostsamma produktionsmetoder och högre priser jämfört med andra typer av läkemedel. Antikroppar är dock bara en grupp av alla proteiner som kan binda till någon typ av molekyl. Intressant nog finns det, på ytan av flera typer av bakterier, proteiner som har utvecklats till att binda specifika delar av antikroppar. På så sätt kan bakterierna gömma sig från immunförsvaret och förhindra antikropparna från att tillkalla hjälp, och de klarar sig därmed längre i våra kroppar. Ett av dessa bakteriella ytproteiner kallas för Protein A, och detta protein spelar en central roll i denna avhandling. Det används vanligtvis i tillverkningsprocessen för antikroppar, i steget där antikropparna ska renas, på grund av förmågan att binda till dessa. Rening av proteiner är nödvändigt då även andra proteiner bildas under tillverkningen. Proteiner kan tillverkas med hjälp av särskilda celler som har modifierats genom att en specifik sekvens DNA har förts in, vilket fungerar som en ritning för proteinet. När cellerna sedan odlas för att producera proteinet, under optimala förhållanden med näring och tillförsel av syre, producerar de också andra proteiner och ämnen som är viktiga för cellen. I de efterföljande reningsstegen behöver dessa ämnen separeras från proteinet av intresse, såsom en specifik antikropp, eftersom de kan ha en inverkan på det tilltänkta användningsområdet. När det gäller läkemedel kan dessa orenheter rentav utgöra ett hot mot patientens hälsa. För att göra sig av med dem kan blandningen av proteiner och andra ämnen tillsättas till en reningsanordning med Protein A, som kan fånga antikropparna, varefter alla andra komponenter kan tvättas bort. Därefter lossas antikropparna från Protein A genom att sänka pH-värdet i lösningen, så att den blir ungefär lika sur som en grapefrukt. Långt ifrån alla antikroppar trivs bra i denna sura miljö, vilket begränsar utvecklingen av nya antikroppar trots hög användningspotential.I studierna som denna avhandling handlar om har vi därför tagit fram en ny metod för att rena antikroppar som inte kräver en sur miljö. Metoden är baserad på Protein A, som har modifierats med syfte att göra proteinet beroende av kalcium för att kunna binda till antikropparna. Genom att ta bort kalcium från lösningen släpper proteinet antikropparna vid ett nära neutralt pH, inte långt ifrån pH-värdet i vår blodcirkulation. Det visade sig genom analyser kunna leda till en avsevärt förbättrad kvalitet på antikroppen jämfört med nuvarande metoder, och möjliggör därmed forskning och utveckling av nya antikroppar som är känsliga för syra. Vidareutveckling av det nya proteinet och reningsmetoden har lyckats göra de flesta aspekterna jämförbara med de etablerade reningsmetoderna som används vid tillverkning av antikroppsläkemedel idag. Metoden har även prövats i en komplett tillverkningsprocess av antikroppar som utformats för att helt undvika en sur miljö i alla steg. Denna process innehåller även steg för att inaktivera virus som kan förekomma vid tillverkningen, samt ytterligare reningsmetoder som används som komplement, och har implementerats både i liten skala och pilotskala. Den nya metoden och processen i helhet visade sig prestera minst lika bra som dagens processer, och var i vissa aspekter överlägsen dessa. Den var även nyskapande genom att moderna tekniker användes och integrerades så att produktionen och reningen av antikropparna kunde ske kontinuerligt från processens början till slut, till skillnad från de kostsamma, stegvisa processer som är normen idag. Kontinuerlig tillverkning är standard inom många andra industrier och har förutspåtts förvandla framtagningen av biologiska läkemedel i framtiden på grund av minskade omkostnader och miljöpåverkan samt förbättrad produktkvalitet. Den banbrytande process som presenteras i denna avhandling kan alltså inte bara användas för att ta fram fler antikroppar utan även bidra till att göra dessa dyra läkemedel mer tillgängliga för patienterna.Vidare kan sura förhållanden påverka kvaliteten på antikroppsfragment i en ännu högre grad, då dessa ofta är mindre stabila än hela antikroppar. Därför har vi även arbetat med att ta fram en mild reningsmetod för dessa. Den antikroppsbindande varianten av Protein A användes som utgångspunkt för att skapa en stor samling av nya varianter med kalciumberoende egenskaper. Därifrån kunde proteiner som bara binder antikroppsfragment i närvaro av kalcium selekteras fram. De utvecklades för användning i en reningsanordning och visade sig ha potential att binda till många olika antikroppsfragment och släppa dessa vid neutralt pH. Kalciumberoende egenskaper kan även vara användbara för andra ändamål, såsom för proteinbaserade läkemedel, och av denna anledning selekterades varianter fram som band till sex andra intressanta proteiner. Sammanfattningsvis har vi tagit fram flera nya proteiner i arbetet att förbättra reningsprocesserna för antikroppar och antikroppsfragment. Dessutom har en ny process utvecklats, baserad på ett av dessa proteiner, för en kontinuerlig och effektiv tillverkning av ett bredare spann av antikroppar, oavsett känslighet för lågt pH. Förhoppningsvis kommer dessa framsteg att öppna upp för utveckling och rening av fler antikroppar och fragment i framtiden, och inspirera till nya tillverkningsprocesser som kan göra dessa effektiva läkemedel billigare och mer lättillgängliga. 

Subject headings

NATURVETENSKAP  -- Biologi -- Biokemi och molekylärbiologi (hsv//swe)

NATURAL SCIENCES  -- Biological Sciences -- Biochemistry and Molecular Biology (hsv//eng)

TEKNIK OCH TEKNOLOGIER  -- Industriell bioteknik -- Bioprocessteknik (hsv//swe)

ENGINEERING AND TECHNOLOGY  -- Industrial Biotechnology -- Bioprocess Technology (hsv//eng)

Keyword

Antibodies

Antibody fragments

Biomanufacturing

Protein purification

Protein engineering

Protein A

ZCa

Calcium

Mild elution

Bioteknologi

Biotechnology

Publication and Content Type

vet (subject category)

dok (subject category)