Tools for the development of intensified perfusion processes for mammalian cell culture

• Recombinant protein therapeutics have become an indispensable part of modern medicine to treat a wide variety of diseases. Their manufacture is mostly based on mammalian cells with fed-batch production bioreactors and downstream batch purification unit operations. Although significant improvements have been made over the last decades to yield high production titers, concerns about their high capital investment costs and limitations in production flexibility have been raised. As a result, the biopharmaceutical industry is slowly transitioning to continuous biomanufacturing with perfusion bioreactors and integrated continuous downstream processes. The potential to maintain very high cell densities over extended process times in a perfusion culture offers higher volumetric productivities in comparison to fed-batch. This intensified production of recombinant proteins can be performed in smaller volumes, thus reducing equipment size and capital costs. However, new challenges are emerging from this shift to continuous bioprocessing. These include the lack of available scale-down models to streamline process development programs, limited knowledge on the optimization of culture medium and perfusion feed strategy, and shortage of tools for the in-line monitoring of relevant culture parameters to ensure stable perfusion operation with consistent product quality.This thesis presents tools for the development of intensified perfusion processes with mammalian cells. Monoclonal antibody producing Chinese Hamster Ovary (CHO) cells or erythropoietin producing Human Embryonic Kidney (HEK293) cells were used as model organisms in the studies. Efforts were made to develop a small-scale perfusion system of 200 mL optimized for long-term steady-state cultivations with achievable cell densities of at least 108 cells/mL. It was shown that volumetric productivities increased linearly with the cell density, thus demonstrating successful process intensification by high cell density perfusion. The small scale of this perfusion bioreactor enabled the conduction of a larger number of experiments with reduced workload and material consumption in a shorter timeframe in the following studies. To control the formation of byproducts, such as lactate, and the N-glycosylation of antibodies, which is an important quality attribute, a novel feed strategy for sugars including glucose, mannose and galactose was developed and implemented. With this feeding strategy, the sugars are delivered to match a target cell specific consumption rate, independent of the cell specific perfusion rate (CSPR). Furthermore, a high cell density perfusion process at a CSPR of 15 pL cell-1 day-1 was developed with high specific antibody productivity after sequential scanning of multiple steady states with various cell densities and perfusion rates. The dynamics in culture parameters from these development runs allowed the calibration of predictive models based on Raman spectroscopy, to enable real-time monitoring of multiple parameters in a perfusion culture. It was shown for example that the N-glycosylation profile was predicted with sufficient accuracy in validation experiments. Moreover, the perfusion process developed on small scale was transferred to a 30 L pilot-scale process, where it was successfully operated for 20 days. The steady state operation ensured a consistent product quality and the integrated continuous downstream process removed most impurities, while ensuring a high recovery yield. Finally, a strategy for perfusion medium optimization in CHO cell cultures operated with very low CSPR was presented by utilizing microbioreactors in combination with design of experiments methodology.To conclude, the strategies presented in this thesis provide a new toolbox for the development and control of intensified perfusion processes, and supports the biopharmaceutical industry in their efforts to swiftly adapt continuous bioprocessing in commercial manufacturing of recombinant proteins.

• Rekombinant proteinbaserade bioläkemedel har blivit en oumbärlig del av modern medicin för behandling av en mängd olika sjukdomar. Deras tillverkning är huvudsakligen baserad på däggdjursceller producerade i fed-batch odlingar i bioreaktorer, följt av nedströms reningsprocess utfärd batchvis. Trots att betydande förbättringar har skett under de senaste decennierna för att öka deras produktionstitrar, är deras höga kapitalinvesteringskostnader och begränsningar i produktionsflexibilitet problematiska. Till följd av detta övergår den biofarmaceutiska industrin sakta mot kontinuerlig tillverkning med perfusionsbioreaktorer och integrerade kontinuerliga nedströmsprocesser. Potentialen att upprätthålla mycket höga celltätheter under långa processtider i en perfusionsodling ger högre volymetrisk produktivitet jämfört med fed-batch. Denna intensifierade produktion för rekombinanta proteiner kan utföras i mindre volymer vilket minskar storlek på utrustning och kapitalkostnader. Nya utmaningar uppstår dock vid övergång till kontinuerlig process. Dessa inkluderar brist på nedskalningsmodeller för att effektivisera processutveckling, begränsad kunskap om optimering av odlingsmedium och strategier for perfusion, samt brist på verktyg för in-line monitoring av relevanta odlingsparametrar för att säkerställa stabil perfusionsproduktion med konsekvent produktkvalitet.Denna avhandling presenterar verktyg för utveckling av intensifierade perfusionsprocesser baserade på däggdjursceller. Monoklonal antikropps-producerande Chinese Hamster Ovary celler (CHO) eller erytropoietin-producerande humana embryonala njurceller (HEK293) användes som modellorganismer i studierna. Ett småskaligt perfusionssystem på 200 mL utvecklades, optimerat för långtidsodlingar i stabilt tillstånd med celltätheter på minst 108 celler/ml. Den volymetriska produktiviteten ökade linjärt med celltätheten, vilket visade framgångsrik processintensifiering med perfusion vid hög celltäthet. Tack vare den lilla storleken på perfusionsbioreaktorn, kunde ett större antal experiment med minskad arbetsbelastning och materialförbrukning genomföras inom en kortare tidsram i följande studier. För att kontrollera skapandet av biprodukter, såsom laktat, och N-glykosyleringen av antikroppar, vilket är en viktig kvalitetsegenskap, implementerades en ny feedingsstrategi för sockerarter inklusive glukos, mannos och galaktos. Med denna feedingsstrategi levereras sockerarterna för att matcha en målcellspecifik konsumtionshastighet, oberoende av den cellspecifika perfusionshastigheten (CSPR). Vidare utvecklades en perfusionsprocess med hög celltäthet vid en CSPR på 15 pL cell-1 dag-1 med hög specifik antikroppsproduktivitet efter sekventiell skanning av flera steady-states med olika celltätheter och perfusionshastigheter. Dynamiken i odlingsparametrar från dessa utvecklingskörningar möjliggjorde kalibrering av prediktiva modeller baserade på Raman-spektroskopi, för att möjliggöra realtidsmonitorering av flera parametrar i en perfusionsodling. Till exempel förutspåddes N-glykosyleringsprofilen med tillfredsställande noggrannhet i valideringsexperiment. Dessutom överfördes den perfusionsprocessen utvecklad i liten skala till en 30 L pilotskalaprocess, där den drevs framgångsrikt i 20 dagar. Driften i steady-state säkerställde en konsekvent produktkvalitet och den integrerade kontinuerliga nedströmsprocessen tog bort de flesta föroreningar, samtidigt som ett högt utbyte uppnåddes. Slutligen presenteras en strategi för optimering av perfusionsmedium för CHO-cellodlingar drivna vid mycket låg CSPR, genom att använda mikrobioreaktorer i kombination med Design of Experiment-metodik.Sammanfattningsvis presenterar denna avhandling en verktygslåda med strategier för utveckling och kontroll av intensifierade perfusionsprocesser, samt stöder den biofarmaceutiska industrin i deras anpassning till kontinuerlig bioprocessteknik för kommersiell tillverkning av rekombinanta proteiner.

Ämnesord

TEKNIK OCH TEKNOLOGIER  -- Industriell bioteknik -- Bioprocessteknik (hsv//swe)

ENGINEERING AND TECHNOLOGY  -- Industrial Biotechnology -- Bioprocess Technology (hsv//eng)

Nyckelord

Recombinant protein biomanufacturing

Perfusion process

Integrated continuous bioprocessing

Monoclonal antibody

Erythropoietin

Chinese Hamster Ovary cells

Human Embryonic Kidney cells

Perfusion medium optimization

Cell specific perfusion rate

Raman spectroscopy

N-glycosylation

Microbioreactors

Design of Experiments

Biotechnology

Bioteknologi

Publikations- och innehållstyp

vet (ämneskategori)

dok (ämneskategori)