DNA methylation in T cell leukaemia

• T cell acute lymphoblastic leukaemia (T-ALL) is a predominantly paediatric cancer that stems from malignant transformation of developing T cells. While the disease has an overall survival rate of 80%, the intense chemotherapy treatment causes severe toxicity and long-term side effects. Furthermore, the survival rate for patients in relapse is less than 25%. Consequently, there is a need for improved therapy options to reduce treatment-related side effects and improve the survival rate of relapsed patients. Targeting aberrant DNA methylation with hypomethylating agents (HMAs) has been successful in the treatment of myelodysplastic syndromes and acute myeloid leukaemia but has not been routinely used in the treatment of T-ALL, despite DNA hypomethylation being observed in T-ALL patients. In this work, we employed a comprehensive set of molecular and sequencing-based techniques to explore the possibilities of HMAs as a treatment option for T-ALL.We made the discovery that the DNA demethylating enzyme ten-eleven translocation 2, TET2, is downregulated or completely silenced in primary T-ALL. Moreover, the TET2 promoter was highly methylated in a group of patients, suggesting that TET2 itself can be silenced through DNA methylation in T-ALL. By treatment with HMAs, TET2 was demethylated in T-ALL cell lines and was one of few genes that was activated upon loss of DNA methylation, indicating that TET2 expression is regulated by DNA methylation in T-ALL cell lines. The development of a novel HMA, the DNMT1-specific inhibitor GSK-3685032, offers a tool to reveal the mechanism of action of the traditional HMAs, 5- azacytidine and decitabine, and to study the effects of acute loss of DNA methylation on cancer cells. We found that 5-azacytidine and decitabine are cytotoxic to T-ALL cells primarily by creating DNA double strand breaks. In contrast, GSK did not prompt a DNA damage response and instead reduced global DNA methylation to as little as 18% with limited cytotoxicity only occurring after levels of DNA methylation had dropped below 30%, a level of demethylation not achieved with DEC or AZA.T-ALL is more than two times more common in boys than girls and mutations in X-linked tumour suppressor genes that escape X inactivation, have been suggested as an underlying cause for the observed sex-bias. In theory, these aberrations would be more detrimental in XYmale cells than in XX-female cells due to the presence of an extra protective copy of the gene in females. We profiled DNA methylation during T cell development and created a map of sex-specific gene expression and expression from the inactive X chromosome, finding that some, but not all, suggested tumour suppressor genes in fact escape X inactivation. These results highlight the importance of profiling the healthy cells that T-ALL arises from to correctly judge the functional impact of gene dysregulation in cancer.In the last study, we aimed to investigate the role of N6-adenine methylation (6mdA) during T cell differentiation. While 6mdA is common in bacteria it is much rarer in humans. Nevertheless, 6mdA has previously been associated with several cellular processes, including cancer progression. Our study calls the presence of 6mdA in mammals into question by exposing limitations of the techniques used in its analysis. We show that contamination with bacterial DNA or 6mAcontaining RNA, nonspecific antibody binding, and low precision of third-generation sequencing techniques all hinder the detection and investigation of rare DNA modifications, such as 6mdA.Together, this work is an in-depth study of the function and the potential of DNA methylation in the biology of healthy and malignant T cells.

• T-cells akut lymfatisk leukemi (T-ALL) är en blodcancer som främst drabbar barn. Trots att sjukdomen har en överlevnadsgrad på 80% orsakar den intensiva behandlingen med kemoterapi allvarlig toxiska effekter och långsiktiga biverkningar. Dessutom är överlevnadsgrad för patienter i återfall mindre än 25%. Följaktligen finns det ett behov av att utveckla bättre alternativ för patienterna för att minska behandlingsrelaterade biverkningar och förbättra överlevnadschans vid återfall. Att rikta sig mot avvikande modifikationer på DNAt som inte medför ändring i genetiska koden, även kallade DNA-metylering, med hypometylerande läkemedel (HMAs), som minskar antalet av dessa modifikationer på DNAt, har varit framgångsrikt vid behandling av andra blodcancerformer, men har inte rutinmässigt använts vid behandling av T-ALL.DNA-metylering är en kemisk modifiering av DNA som stänger av gener i dess närhet. Tidigare studier har visat att DNA-metyleringsprofiler förändras i alla cancerformer och särskilt gener som förhindrar utvecklingen av cancer, så kallade tumörsuppressorgener, stängs av genom DNA-metylering. I denna doktorsavhandling använde jag en omfattande uppsättning av laboratorie- och beräkningsmetoder för att genomföra en djupgående studie av DNA-metyleringens funktion i friska T-celler och T-ALL. Jag utforskade också möjligheten att korrigera DNA-metylering i cancerceller med hjälp av HMAs som ett behandlingsalternativ för T-ALL.Vi gjorde upptäckten att den kända tumörsuppressorgenen TET2 är mindre vanlig eller helt förlorad i T-ALL celler jämfört med friska celler. Vi såg också att TET2-genen var metylerad hos en grupp T-ALL-patienter, vilket tyder på att TET2 självt kan stängs av genom DNA-metylering i T-ALL. Genen TET2 förlorade sin DNA-metylering och aktiverades efter behandlingen av celler från T-ALL.Vi såg även att traditionella HMAs, som redan används kliniskt, endast har en begränsad förmåga att ta bort DNA-metylering och att de främst dödar cancerceller genom att skada deras DNA. I jämförelse med detta kunde det nya läkemedlet GSK-3685032 minska DNA-metylering betydligt mer kraftfullt och gav oss möjligheten att studera konsekvenserna av den omfattande förlusten av DNA-metylering i T-ALL- celler.Den tredje studien i denna avhandling fokuserade på det faktum att T-ALL är mer än två gånger vanligare hos pojkar än hos flickor. En stor skillnad mellan pojkar och flickor är att kvinnliga celler har två X-kromosomer medan manliga celler har en Y- och en X-kromosom. De flesta gener på en av X-kromosomerna hos kvinnor är inaktiverade, men cirka 15% av X-länkade gener undkommer denna avstängning. Detta medför att det är två kopior av dessa gener som är aktiva i kvinnliga XX-celler och endast en är aktiv i manliga XY-celler. Dessa ytterligare kopior av aktiva tumörsuppressorgener från X-kromosomen har föreslagits skydda flickor från att utveckla T-ALL och kan förklara den högre risken för att utveckla sjukdomen hos pojkar. Vi profilerade DNA-metylering under T-cellsutveckling och skapade en karta över aktivitet på gener från X-kromosomen i manliga och kvinnliga celler. Vi fann att vissa, men inte alla, föreslagna tumörsuppressorgener faktiskt undkom X-inaktivering och är aktiva från båda X-kromosomer. Dessa resultat understryker vikten av att profilera de friska celler som T-ALL uppstår från för att korrekt bedöma de funktionella konsekvenserna av förändringar som ses vid cancer.I vår sista studie fokuserade vi på en specifik typ av DNA-metylering (kallad 6mdA) som är vanlig hos bakterier men mycket ovanligare hos människor. 6mdA har associerats med flera processer i friska celler och cancerceller. Vår studie ifrågasätter om 6mdA finns hos människor. Vi visade begränsningarna i de tekniker som används för analys av 6mdA. Förorening med bakteriellt DNA eller 6mA-innehållande RNA, ospecifik bindning av antikroppar och låg precision hos sekvenseringstekniker förhindrar upptäckt och undersökning av sällsynta DNA-modifikationer, såsom 6mdA.Sammanfattningsvis är detta arbete en djupgående studie av DNA-metyleringens funktion och potential i biologin hos friska T-celler och T-cells cancer.

Ämnesord

MEDICIN OCH HÄLSOVETENSKAP  -- Medicinska och farmaceutiska grundvetenskaper -- Cell- och molekylärbiologi (hsv//swe)

MEDICAL AND HEALTH SCIENCES  -- Basic Medicine -- Cell and Molecular Biology (hsv//eng)

Publikations- och innehållstyp

vet (ämneskategori)

dok (ämneskategori)