Antithrombotic Effects of Activated Protein C and Heparins in Deep Arterial Injury

• The investigations presented in this thesis have evaluated different strategies to prevent thrombosis in an experimental model of deep arterial injury in rats. Unfractionated heparin (UFH) is often used to prevent thrombosis in microvascular surgery and in other vascular interventions, but a major drawback of UFH is increased bleeding. In the first paper the low-molecular-weight heparin (LMWH) dalteparin prevented arterial thrombosis as effectively as UFH but with less bleeding. In the second paper increasing doses of plasma purified bovine activated protein C (bAPC), with or without co-administration of bovine protein S (bPS) demonstrated the in vivo significance of PS as a cofactor to APC, and that potent antithrombotic effect could be achieved by low doses of bAPC combined with bPS, without producing hemorrhagic side effects. Recent in vitro studies have shown enhanced anticoagulant effect of human activated protein C (hAPC) by selective mutagenesis of the Gla-domain. This mutant was combined with mutations in the protease domain of hAPC, in loop 148, that was changed to the four residues shorter corresponding loop in bAPC leading to even more enhanced anticoagulant activity due to higher catalytic activity against its natural substrates FVa and FVIIIa. In vitro clotting experiments in rat plasma showed distinct dose dependent anticoagulant effect, especially with the combined mutant in contrast to wild type (WT) hAPC that only slightly prolonged the clotting time. These results generated the hypothesis that the mutants given without hPS could be antithrombotic in our rat model. In the third paper, none of the APC variants had significant antithrombotic effect even though the ex vivo clotting times were clearly prolonged. In the fourth paper further in vitro experiments showed additional prolongation of the clotting time in rat plasma when either of the two mutants was combined with hPS, compared to almost no effect with WT-hAPC. This indicated that the mutants combined with hPS could be antithrombotic, but even though increased patency rates were noted with the combined mutant, there was no significant antithrombotic effect. These results stand in contrast to the strong antithrombotic effect demonstrated with bAPC combined with bPS. The reason for this species discrepancy is unknown.

• Popular Abstract in Swedish När en kärlskada uppstår måste skadan repareras innan alltför mycket blod hinner lämna blodbanan. Kärlet självt kan dra ihop sig till viss del för att minska blodflödet. Vid kärlskadan exponeras strukturer som normalt inte skall ha kontakt med blodet, en sådan struktur är t.ex. ämnet kollagen. Till kollagenet binds blodplättar (trombocyter) som tillfälligt täpper till skadan i kärlväggen. Ett annat ämne som exponeras vid skadan är proteinet tissue factor (vävnadsfaktor). Till tissue factor binds aktiverad koagulationsfaktor VII, som normalt finns aktiverad i en liten mängd, och därefter sker en serie reaktioner mellan olika koagulationsfaktorer vilket till slut leder fram till bildningen av ett fibrinnät som stabiliserar den initiala trombocyt-pluggen. Koagulationsprocesserna sker effektivast på fosfolipidytor, vilket det finns på de trombocyter som ansamlats och aktiverats på platsen för kärlskadan. För att begränsa koagulationen finns det flera motverkande system. Protein C systemet bromsar koagulationsprocessen genom att aktiverat protein C (APC) klyver och på så sätt inaktiverar två av de mest centrala koagulationsfaktorerna. Dessa är faktor V och VIII som i aktiverad form annars sitter på trombocytytan och bidrar till explosionsartad bildning av trombin som omvandlar fibrinogen till olösligt fibrin. Trombin aktiverar både trombocyter och koagulationsfaktorer vilket leder till ytterligare ansamling av trombocyter och ökad koagulation. Trombin begränsar även sin egen produktion genom att bindas till proteinet trombomodulin och detta komplex aktiverar sedan protein C. Antitrombin, är som namnet antyder, ett annat protein som kan hämma trombin. Denna hämning förstärks kraftigt av ämnet heparin, som binder till antitrombin som då får en bättre förmåga att hämma trombin. Även andra koagulationsfaktorer hämmas av antitrombin, och då framförallt aktiverad faktor X. Heparin används bl.a. för att minska proppbildningar vid ballongvidgning i hjärtat och i andra kärl och vid öppen kärl- och hjärtkirurgi. Många nya ersättningalternativ till heparin har presenterats genom åren, men heparin har fortfarande sin plats i kliniken som antitrombotiskt medel. En vanlig och oönskad biverkan av heparinbehandling är blödningsproblem. I vår första studie jämfördes standardheparin med en heparinvariant som tillverkats genom nedbrytning av standardheparin till mindre delar. De kortare heparinfragmenten leder till att aktiverad koagulationsfaktor X hämmas förhållandevis mer än thrombin. Det visade sig att denna lågmolekylära heparinvariant hade lika bra antitrombotisk effekt som heparin men orskade mindre blödning i vår experimentella trombosmodell. Experimenten utfördes på råtta där man med mikrokirurgisk teknik skapade en väldefinierad djup kärlskada i den ena halspulsådern (arteria carotis communis). Om man inte ger något antitrombotiskt medel bildas det en propp i det opererade kärlet inom några minuter. I de resterande tre studierna studerades de antitrombotiska effekterna av olika former av aktiverat protein C. Protein C framställt från blodplasma från nötkreatur (bovint protein C) visade sig vara effektivt i aktiverad form som antitrombotiskt medel tillsammans med sin ”hjälp-faktor” bovint protein S. Däremot fann vi ingen antitrombotisk effekt med humant aktiverat protein C. Med hjälp av DNA-tekniker kan man byta ut delar i protein C molekylen och på så sätt förändra dess egenskaper så att t.ex. den antikoagulanta effekten förstärks. Provrörsförsök, s.k. in vitro studier, i råttplasma visade lovande resultat gällande förstärkt antikoagulant effekt med två strukturförändrade varianter av humant protein C. När dessa testades i våra experiment på råtta visade de dock ingen statistiskt säkerställd antitrombotisk effekt jämfört med kontrollgruppen. Detta blev också resultatet då vi gjorde om försöken i den fjärde studien tillsammans med ”hjälp-faktorn” humant protein S, trots att provrörsförsöken även här hade visat lovande resultat. Orsaken till denna stora skillnad i antitrombotisk effekt i råtta, mellan protein C från nötkreatur och människa, är oklar.

Ämnesord

MEDICIN OCH HÄLSOVETENSKAP  -- Klinisk medicin -- Kirurgi (hsv//swe)

MEDICAL AND HEALTH SCIENCES  -- Clinical Medicine -- Surgery (hsv//eng)

Nyckelord

traumatology

Kirurgi

ortopedi

traumatologi

orthopaedics

Surgery

mutagenesis

protein S

protein C

heparin

bleeding

arterial thrombosis

animal model

Publikations- och innehållstyp

dok (ämneskategori)

vet (ämneskategori)