Role of platelets and neutrophils in regulating trypsinogen activation and tissue damage in acute pancreatitis

• Acute pancreatitis is an inflammatory disease characterized by a diverse spectrum of clinical presentations ranging from a mild and self-limiting to a severe and systemic disorder. The relationship between inflammation and proteolytic activation in pancreatitis is an elusive issue. The aim of this thesis was to define the influence of platelets and neutrophils as well as their interrelations in relation to trypsinogen activation and tissue damage in pancreatitis. For this purpose, three different experimental models of acute pancreatitis were used in mice. Pancreatitis was induced by retrograde infusion of taurocholate into the pancreatic duct, by intraperitoneal administration of caerulein or L-arginine. Severity of pancreatitis was evaluated by morphological examination of the pancreas as well as serum and pancreatic biochemical markers. Intravital fluorescence microscopy was used to study leukocyte-endothelial interactions in the pancreatic microcirculation. Flowcytometry was used to quantify platelet-neutrophil aggregates and adhesive molecule expression on cells. Induction of pancreatitis provoked a clear cut tissue damage characterized by increased neutrophil infiltration, myeloperoxidase and macrophage inflammatory protein-2 levels, trypsinogen activation peptide, acinar cell necrosis, oedema formation and haemorrhage in the pancreas, as well as elevated serum amylase activity. Depletion of platelets and neutrophils reduced pancreatic tissue damage, neutrophil accumulation and macrophage inflammatory protein-2 formation as well as amylase levels. Also, it was found that initial trypsinogen activation is independent of neutrophils, whereas later activation is dependent on neutrophils and mediated by neutrophil-derived matrix metalloproteinase-9 in the pancreas. Platelets were found to regulate neutrophil recruitment in to the pancreas via upregulating P-selectin on pancreatic microvasculature. Depletion of platelets and inhibition of P-selectin not only reduced leukocyte rolling but also tissue damage in acute pancreatitis. Thus, targeting both neutrophil and platelet functions may be a useful strategy in the management of acute pancreatitis.

• Popular Abstract in Swedish POPULÄRVETENSKAPLIG SAMMANFATTNING PÅ SVENSKA Akut inflammation i bukspottskörteln (akut pankreatit, AP) är en vanlig sjukdom som oftast debuterar med kraftiga buksmärtor och ibland illamående och kräkningar. De flesta patienter, ungefär 80%, får en mild form av sjukdomen som begränsas till just bukspottkörteln (pancreas), och dessa patienter tillfrisknar efter några dagars sjukhusvård. De resterande, dvs ungefär 20%, utvecklar en svår akut pankreatit vilket innebär komplikationer, antingen lokalt i bukspottkörteln, eller systemiskt i andra organ. Dödligheten i denna grupp är 10-30%. Det finns i dag ingen specifik behandling av AP vilket delvis beror på att vi inte vet vilka sjukdomsmekanismer som gör att en pankreatit utvecklas till svår. Pankreas har två huvudsakliga funktioner; dels den endokrina produktionen av hormoner (t ex insulin) och dels den exokrina produktionen av matsmältningsenzym. Inflammationen uppkommer i de exokrina delarna. De flesta enzym produceras i bukspottkörteln i en inaktiv form och utsöndras till tolvfingertarmen där de aktiveras och på så sätt kan bryta ned födan. Vid akut pankreatit, och framför allt svår akut pankreatit, har man noterat en för tidig aktivering av bukspottkörtelenzym redan i bukspottkörtelns acinära celler. Det mest studerade enzymet, trypsin har förmågan att aktivera alla andra proenzym och kan också påverka många andra biologiska processer. Såväl graden av trypsinaktivering som inflammation korrelerar till sjukdomens svårighetsgrad. Man ser även en vävnadsskada i pankreas, framför allt vid svår sjukdom. Vid vävnadsskada frigörs kemokiner som är molekyler som kemotaktiskt aktiverar och drar till sig vita blodkroppar (leukocyter) till inflammationshärden. Vid AP verkar de neutrofila leukocyterna spela en avgörande roll. De rekryteras till bukspottkörteln från blodbanan genom en trestegsprocess där de först saktar ner; rullar, sedan fastnar (adhererar) på kärlväggen med hjälp av vidhäftningsmolekyler för att slutligen gå igenom kärlväggen mot inflammationshärden. De exakta mekanismerna och deras betydelse för sjukdomsutvecklingen vid AP är emellertid inte klarlagda. De arbeten som ingår i denna avhandling grundar sig på djurexperimentella studier och cellförsök. Experimentell AP har inducerats antingen genom upprepade injektioner av cerulein (50μg/kg intraperitonealt en gång/timme i 7 timmar) eller L-arginin (8%, 4g/kg intraperitonealt 2 gånger med en timmes mellanrum) eller genom infusion av gallsaltet taurocholat (10μl, 5%, 2 μl/min) i pankreasgången. Vidare har pankreas acinära celler isolerats. Nivåer av trypsinaktivering har mätts indirekt genom trypsinogenets aktiveringspeptid (TAP) eller genom direkt trypsinaktivitet. Inflammationen har mätts dels i form av antalet infiltrerade leukocyter till vävnaden och dels genom myeloperoxidasaktivitet (MPO) vilket speglar de neutrofila leukocyternas aktivering och mängd i vävnaden. Vidare har nivån av kemokiner, framför allt macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2), mätts och graden av vävnadsskada bestämts histologiskt. Interaktionen mellan neutrofila leukocyter och kärlväggen har studerats med intravital fluorescens mikroskopi (IVM) på sovande möss med pågående AP. Avhandlingen utgörs av 6 arbeten. I det första arbetet studeras blodplättarnas (trombocyternas) betydelse för inflammation och vävnadsskada vid AP. Möss med cerulein inducerad AP där 85% av trombocyterna slagits ut av en antikropp uppvisade betydligt mindre inflammation och vävnadsskada jämfört med kontrollmöss. Resultaten upprepades vid L-arginin utlöst AP. För att vidare studera mekanismerna bakom detta underöktes betydelsen av P-selektin i nästa studie. P-selektin är en molekyl som uttrycks på trombocyter vid aktivering, men som också visats bidra till rekryteringen av neutrofila leukocyter vid andra inflammatoriska tillstånd. 67 När P-selektin blockerats med en antikropp sågs en kraftig minskning av såväl MPO som antalet neutrofila leukocyter i pankreas efter taurocholatinfusion. Nivåerna av TAP var kraftigt förhöjda i djur med taurocholatinducerad AP och minskades inte signifikant vid P-selektin blockad. Liknande resultat sågs för nivåer av MIP-2. IVM visade att de neutrofila leukocyternas rullning minskades kraftigt efter injektion av P-selektin antikroppar i såväl taurocholat- som cerulein- och arginininducerad AP. För att ytterligare klargöra de neutrofila leukocyternas betydelse tillfördes en antikropp (Gr-1), som resulterade i att 97% av de neutrofila leukocyterna slogs ut, innan induktion av AP. Detta medförde att pankreatitens svårighetsgrad efter 24 timmar minskade avseende vävnadsskada, MPO, antal leukocyter i vävnaden och även att TAP och MIP-2 nivåerna minskade. Således minskade trypsinaktiveringen när de neutrofila granulocyterna var utslagna, till skillnad från resultatet vid P-selektin blockad när de neutrofila leukocyterna fanns kvar i blodbanan men inte rekryterades till pankreas. Två timmar efter induktion av pankreatit var däremot TAP nivåerna liknande i kontroll möss och möss som fått Gr-1 antikropp. Vi konkluderar att den initiala trypsinaktiveringen är oberoende av neutrofiler och hypotetiserar att ett ämne som utsöndras från de neutrofila granulocyterna orsakar ytterligare trypsinaktivering efter 24 timmar. I nästa studie undersöktes huruvida matrix metalloproteinaser (MMPs) kunde spela en roll i denna process. När en generell hämmare av MMPs användes fick man en mildare pankreatit med mindre vävnadsskada, trypsinaktivering, neutrofilrekrytering och lägre MPO och MIP-2 nivåer i taurocholatmodellen jämfört med kontrolldjur som inte fått MMP hämmare. Vidare uppmättes förhöjda serum nivåer av MMP-9, men inte av MMP-2 denna modell. Möss med genetisk avsaknad av MMP-9 (MMP-9 KO) uppvisade en mildare pankreatit liknande den som uppnåtts med generell MMP utslagning. Ytterligare försök visade att MMP-9 kan inducera trypsinfrisättning från acinära celler och att celler från MMP-9 KO möss utsöndrade mindre trypsin vid stimulering jämfört med kontroll celler. Sammanfattningsvis kan man konkludera att MMP-9 kan vara en länk mellan neutrofila leukocyter och den senare trypsinaktivering som setts efter 24 timmar. För att försöka utröna vilka exakta mekanismer som gör att trombocyterna påverkar svårighetsgraden av AP undersöktes CD40L som är ett proinflammatorisk protein som bland annat uttrycks på aktiverade trombocyter. Genmodifierade möss som inte uttrycker CD40L fick emellertid lika kraftig AP som kontrollmöss i såväl taurocholat som cerulein modellen. Resultaten upprepades när CD40L funktionen blockerades med en antikropp. Således verkar inte CD40L vara den mekanism som styr trombocyternas påverkan på svårigheten vid AP. I det sista arbetet undersöktes trombocyternas förmåga att påverka leukocytrekrytering och leukocyt-endotel interaktioner vid ceruleininducerad AP. Genom att använda IVM fann vi att frånvaro av trombocyter minskade leukocyternas förmåga att rulla och att adherera till kärlväggen. Vi fann också att P-selektin uttrycket, som ökades vid cerulein stimulering, minskades i frånvaro av trombocyter. Vid andra inflammatoriska tillstånd har trombocyter setts bilda komplex med neutrofila leukocyter. Vi undersökte dessa komplex och dess påverkan på leukocytrekrytering för att utröna om trombocyterna genom denna mekanism påverkar förloppet vid AP. Vi fann en ökad mängd trombocyt-leukocyt komplex vid AP, men kunde inte finna att dessa påverkade infiltrationen av leukocyter till pankreas. Sammanfattningsvis har vi undersökt betydelsen av trombocyter och neutrofila leukocyter vid AP och funnit att båda dessa celltyper har betydelse för svårighetsgraden vid sjukdomen.

Ämnesord

MEDICIN OCH HÄLSOVETENSKAP  -- Klinisk medicin -- Kirurgi (hsv//swe)

MEDICAL AND HEALTH SCIENCES  -- Clinical Medicine -- Surgery (hsv//eng)

Nyckelord

Protease activation

adhesion molecule

chemokine

intravital flourecence microscopy

matrix metalloproteinase.

Publikations- och innehållstyp

dok (ämneskategori)

vet (ämneskategori)