A Study on Trypanosomal Polyamine Biosynthetic Enzymes

• The polyamines, putrescine, spermidine, and spermine, are essential for all forms of life. The polyamine biosynthetic pathway has been shown to be a potential target for drugs against various trypanosomal parasitic diseases. The two main enzymes in the biosynthesis of polyamines are ornithine decarboxylase (ODC) and S-adenosylmethionine decarboxylase (AdoMetDC). ODC catalyzes the first step of polyamine biosynthesis. Mammalian ODC is tightly regulated by polyamines and has a very fast turnover rate. The degradation of this enzyme is 26S proteasome dependent, but ubiquitin independent. The polyamines induce the degradation of mammalian ODC by stimulating the synthesis of a protein termed antizyme, which binds to and targets the enzyme for degradation by the 26S proteasome. Most trypanosomal ODCs, e.g. Leishmania donovani ODC and Trypanosoma brucei ODC are metabolically stable, but, interestingly, Crithidia fasciculata ODC has a fast turnover. In this thesis, the mechanisms involved in the rapid turnover of C. fasciculata ODC are examined. The degradation of C. fasciculata ODC was shown to be rapid also in mammalian systems, whereas that of L. donovani ODC was not. The rapid turnover of the enzyme was markedly reduced by inhibition of the 26S proteasome, indicating the involvement of this proteolytic system in the degradation of C. fasciculata ODC. However, unlike the mammalian ODC, C. fasciculata ODC was not down-regulated by polyamines, suggesting an antizyme independent degradation mechanism. As a result of analyzing the turnover of a series of chimeric ODCs between C. fasciculata ODC and L. donovani ODC, it was found that the central part of the former enzyme is important for its rapid degradation. The characterization of C. fasciculata AdoMetDC, the other main polyamine biosynthetic enzyme, revealed that also this enzyme has an extremely fast turnover (ca 3 min). Furthermore, no polyamine-mediated feedback regulation of AdoMetDC was observed in the parasite. As an alternative to using polyamine biosynthesis inhibitors, CHO cells expressing the trypanosomal ODCs were used to analyze the effects of different polyamine pools on cell cycle progression. It was shown that CHO cells expressing L. donovani ODC had a reduced polyamine synthesis, resulting in a decrease in cellular putrescine and spermidine levels (compared to wild-type CHO cells). On the other hand, the spermine content was increased. The changes in polyamine content were reflected in changes in cell growth kinetics.

• Popular Abstract in Swedish En cell är uppbyggd av många olika ämnen som är livsviktiga för dess liv. Polyaminerna – putrescin, spermidin och spermin – är några av dessa ämnen. Celler måste ha tillräckligt mycket polyaminer för att tillväxten ska ske normalt: för lite gör att cellerna slutar att dela sig och för mycket kan omvandla celler till cancer celler. Kunskap om vad polyaminer gör och hur deras tillverkning kontrolleras är viktig ur medicinsk synpunkt. Vissa typer av cancer kan eventuellt behandlas genom att man hämmar polyaminbildning i cellerna. Det främsta användningsområdet just nu är att behandla sjukdomar som orsakas av encelliga parasiter, så kallade trypanosomatider. Afrikansk sömnsjuka är en sjukdom som drabbar hundratusentals människor varje år och den skördar många liv. Den orsakas av parasiten Trypanosoma brucei. Man kan bota sjukdomen genom att behandla med en substans som hämmar polyaminbildning. Leishmaina donovani som orsakar leishmaniasis, en sjukdom som drabbar de inre organen, är också en plåga för den fattiga befolkningen i världen. För att utveckla bra läkemedel måste man känna till skillnaderna mellan parasiterna och deras värd och därför är karakteriseringen av proteiner (äggviteämnen) som krävs för polyaminbildning i parasiter av stort intresse. Vi har valt att använda oss av insektsparasiten Crithidia fasciculata som är en modellparasit för de sjukdomsalstrande parasiterna. Polyaminer är positivt laddade i celler och binder till cellens negativt laddade komponenter och påverkar därmed komponenternas aktiviteter i cellen. Det finns två proteiner som är viktiga för bildning av dessa ämnen: ornitindekarboxylas (ODC) och S-adenosylmetionindekarboxylas (AdoMetDC). I avhandlingen har vi undersökt C. fasciculata ODC och AdoMetDC. Mängden protein som finns i celler regleras hela tiden på olika sätt. Nedbrytning av proteiner som inte längre behövs är en viktig process. C. fasciculata ODC har en snabb proteinomsättning i cellen. Vi har visat att C. fasciculata ODC bryts ner i ett nedbrytningsmaskineri som kallas 26 S-proteasom. Vi har hittat ledtrådar till hur 26 S-proteasom känner till att C. fasciculata ODC ska nedbrytas. Den del av C. fasciculata ODC som står för proteinets snabba omsättning har också karakteriserats. C. fasciculata AdoMetDC visade sig också att ha en extremt snabb omsättning. Proteinet har en livslängd på bara några minuter. I detta avseende liknar proteinet mer däggdjurs AdoMetDC än andra trypanosom AdoMetDC. I motsats till däggdjurs AdoMetDC, regleras inte C. fasciculata AdoMetDC av polyaminer. En anledning till varför C. fasciculata ODC och AdoMetDC har den snabba omsättningen kan vara att parasiterna lever i en otrygg miljö och därmed snabbt måste kunna ändra mängderna av de här livsviktiga proteinerna. Som jag har nämnt tidigare är polyaminer nödvändiga för att celler ska kunna tillväxa. Ett sätt att undersöka vilken betydelse och på vilket sätt polyaminer är viktiga för cellens tillväxt är att öka eller sänka dess mängd av polyaminer och studera effekten. I mitt arbete har jag påverkat cellers polyaminpooler genom att föra in ODC-gener från C. fasciculata och L. donovani till celler som saknar ODC proteinet. Som kontroll användes celler med en normal ODC-gen. De normala cellerna och cellerna som hade ODC-gener från C. fasciculata och L. donovani hade olika innehåll av polyaminer och cellerna växte och delade sig med olika hastighet. I arbetet försökte vi närmare kartlägga polyaminernas roll i olika faser i cellers tillväxt. Varje år drabbas miljontals människor i framför allt den fattiga delen av världen av olika parasitsjukdomar. Den mest kända parasitsjukdomen är malaria och även när det gäller malaria pågår forskning omkring polyaminer. Med vår forskning hoppas vi kunna bidra till utvecklingen av bättre och billigare behandling av olika typer av parasitisjukdomar.

Ämnesord

MEDICIN OCH HÄLSOVETENSKAP  -- Medicinska och farmaceutiska grundvetenskaper -- Farmakologi och toxikologi (hsv//swe)

MEDICAL AND HEALTH SCIENCES  -- Basic Medicine -- Pharmacology and Toxicology (hsv//eng)

Nyckelord

cell cycle

protein turnover

trypanosomatids

polyamines

Ornithine decarboxylase

S-adenosylmethione decarboxylase

Parasitology (human and animal)

Parasitologi (människa och djur)

Publikations- och innehållstyp

dok (ämneskategori)

vet (ämneskategori)