| 1. |
- Svedendahl, Maria
(author)
-
Exploring Conjugate Addition Activity in Pseudozyma antarctica Lipase B
- 2009
-
Licentiate thesis (other academic/artistic)abstract
- Multifunctional enzymes have alternative functions or activities, known as “moonlighting” or “promiscuous”, which are often hidden behind a native enzyme activity and therefore only visible under special environmental conditions. In this thesis, the active-site of Pseudozyma (formerly Candida) antarctica lipase B was explored for a promiscuous conjugate addition activity. Pseudozyma antarctica lipase B is a lipase industrially used for hydrolysis or transacylation reactions. This enzyme contains a catalytic triad, Ser105-His224-Asp187, where a nucleophilic attack from Ser105 on carboxylic acid/ester substrates cause the formation of an acyl enzyme. For conjugate addition activity in Pseudozyma antarctica lipase B, replacement of Ser105 was assumed necessary to prevent competing hemiacetal formation. However, experiments revealed conjugate addition activity in both wild-type enzyme and the Ser105Ala variant. Enzyme-catalyzed conjugate additions were performed by adding sec-amine, thiols or 1,3-dicarbonyl compounds to various α,β-unsaturated carbonyl compounds in both water or organic solvent. The reactions followed Michaelis-Menten kinetics and the native ping pong bi bi reaction mechanism of Pseudozyma antarctica lipase B for hydrolysis/transacylation was rerouted to a novel ordered bi uni reaction mechanism for conjugate addition (Paper I, II, III). The lipase hydrolysis activity was suppressed more than 1000 times by the replacement of the nucleophilic Ser105 to Ala (Paper III).
|
|
| 2. |
- Merz, Luisa M.
(author)
-
Investigation of transaminase-based synthesis of furfurylamines
- 2024
-
Doctoral thesis (other academic/artistic)abstract
- Biokatalys innebär en betydande möjlighet att förbättra hållbarheten inom den kemiska industrin. Att använda enzymer för kemisk produktion är helt i linje med principerna för grön kemi och möjliggör en snabb, selektiv och avfallssnål syntes av värdefulla föreningar. Transaminaser, i synnerhet, erbjuder potential för selektiv, hållbar och ekonomisk aminproduktion. Flera utmaningar hindrar dock deras bredare industriella tillämpning. Denna avhandling undersöker transaminaset från Silicibacter pomeroyi (SpATA) och hur dess tillämplighet kan förbättras. En kritisk utmaning för transaminaser är deras stabilitet, eftersom det dimeriska enzymet lätt kan dissocieras, vilket leder till en total förlust av funktionalitet. Olika faktorer som påverkar stabiliteten hos SpATA undersöktes, vilket visade att valet av buffert, kofaktorkoncentration och ljusexponering har en betydande inverkan på enzymets stabilitet. Genom att optimera dessa förhållanden förlängdes halveringstiden för SpATA till över 700 timmar.För storskaliga tillämpningar är det viktigt att enzymerna kan återanvändas på grund av de höga kostnaderna för enzymproduktion. Därför immobiliserades SpATA, tillsammans med tre andra transaminaser, på en bärare, vilket gav utmärkt återanvändbarhet utan någon aktivitetsförlust. Dessutom var SpATA:s användning i en flödesreaktor framgångsrik, vilket ytterligare visar på dess industriella potential.För att förbättra hållbarheten hos transaminasreaktionen undersöktes användningen av den ”smarta amindonatorn” kadaverin. Höga utbyten av föreningen HMFA uppnåddes med användning av ekvimolära mängder kadaverin och HMF. För att förbättra processens ekonomiska lönsamhet utvecklades en in-situ kaskadreaktion med lysindekarboxylas och SpATA för produktion av kadaverin.Sammanfattningsvis presenterar denna avhandling utvecklingen av en stabil, återanvändbar biokatalysator som kan uppnå höga produktutbyten, vilket avsevärt främjar tillämpningen av transaminaser i hållbara industriella processer.
|
|
