The expression and function of protein kinase C isoforms in differentiating neuroblastoma cells

• The human neuroblastoma cell line SH-SY5Y can be induced to differentiate into a neuronal sympathetic phenotype after treatment with 16 nM 12-O-tetradecanoyl phorbol 13-acetate (TPA) in serum, or by a combination of the growth factors basic fibroblast growth factor and insulin-like growth factor-I (bFGF/IGF-I). SH-SY5Y cells stably transfected with TrkA, the nerve growth factor (NGF) receptor, differentiate in response to NGF. The function of protein kinase C (PKC) isoforms in these processes was investigated. SH-SY5Y cells were shown to express PKC-alpha, PKC-epsilon and PKC-zeta protein. All three isoforms remained present during TPA- and bFGF/IGF-I-induced differentiation, while a higher TPA concentration (1.6 µM), that does not promote differentiation, down-regulated PKC-alpha completely. The use of the PKC inhibitor GF 109203X demonstrated that TPA-induced differentiation is completely, while growth factor induced differentiation is partially, PKC-dependent. Cells with down-regulated PKC-alpha differentiated in respons to growth factors, implicating a role for PKC-epsilon in this process. Growth cones isolated from differentiated SH-SY5Y cells were enriched in PKC-alpha and PKC-epsilon. Addition of GF 109203X provoked retraction of growth cone filopodia. Together with the finding that cells with down-regulated PKC-alpha form functional growth cones, this result suggests a role for PKC-epsilon in growth cone function. A yeast two-hybrid assay was performed using the regulatory domain of PKC-epsilon as a bait, in order to isolate PKC-epsilon binding proteins. A clone encoding the ribosomal protein fte-1/S3a was isolated and was shown to interact with the regulatory domains of PKC-alpha and PKC-epsilon in vitro. Fte-1 expression decreased in differentiating SH-SY5Y cells, and overexpression of fte-1 prevented induced differentiation, suggesting a function for fte-1 as a negative regulator of PKC. The docking protein p130cas was shown to be PKC-dependently tyrosine phosphorylated in differentiating SH-SY5Y cells. The early phase of p130cas phosphorylation (5-30 min) was independent of pp60c-src or other herbimycin A sensitive kinases, while the late phase could be blocked by herbimycin A. p130cas protein and tyrosine phosphorylated p130cas were enriched in growth cones, indicating a function for the protein in this structure.

• Popular Abstract in Swedish Proteinkinas C i nervcellsutveckling Under fosterutvecklingen ska en enda cell, den befruktade äggcellen, ge upphov till alla de högt specialiserade celler som människokroppen består av. Den process där omogna celler utvecklas till t.ex. nervceller, blodceller och muskelceller kallas differentiering. Det som avgör vad en speciell cell ska utvecklas till är bl.a. vilka s.k. tillväxtfaktorer i omgivningen den utsätts för. Det sympatiska nervsystemet är den del av nervsystemet som aktiveras vid stress och fara. När det bildas ska cellerna dels vandra ut i kroppen från den plats där de anläggs, dels differentiera till mogna nervceller med dendriter och axoner, de nervtrådar som tar emot och sänder signaler. Flera av de tillväxtfaktorer som styr dessa processer är kända, däremot vet man mindre om vilka signaler som sätts igång inuti cellerna när dessa stimulerats av tillväxtfaktorer. I mitt avhandlingsarbete har jag studerat en familj av enzymer i denna process, nämligen proteinkinas C (PKC). Neuroblastom är en cancerform som drabbar små barn när en omogen sympatisk nervcell skadas så att den fortsätter att dela sig ohämmat i stället för att differentiera. Celler från tumörerna kan isoleras och odlas i skålar. Man kan få odlade neuroblastomceller att differentiera genom att tillsätta bl.a. sådana tillväxtfaktorer som leder till utveckling av sympatiska nervceller i fostret. Dessa faktorer binder till och aktiverar särskilda receptorer på cellytan som i sin tur påverkar flera enzymer inuti cellen. Den kaskad av händelser som sätts igång av att en tillväxtfaktor binder till sin receptor leder till att cellen börjar skicka ut axoner och dendriter (kallas gemensamt neuriter på odlade celler) och bildar transmittorsubstanser. Vår grupp har tidigare visat att PKC-familjen aktiveras under denna process. Under mitt avhandlingsarbete har jag undersökt om PKC-aktiveringen är nödvändig för differentieringen och i så fall vilken eller vilka av familjemedlemmarna som behövs. Vidare har jag studerat hur PKC reglerar eller regleras av andra proteiner under differentieringen. PKC-familjen består av minst elva medlemmar (isoformer). Isoformerna har delvis samma struktur och aktiveras på likartat sätt, men verkar ha olika funktioner. Aktivt PKC fosforylerar andra proteiner och ökar eller minskar därmed aktiviteten av dessa. Flera steg av aktivering eller inaktivering av enzymer leder slutligen till att exempelvis en viss gen börjar uttryckas. Anledningen till att olika PKC-isoformer har olika funktioner kan vara bl. a. att de binder till olika ställen i cellen och därmed kommer i närheten av olika substrat. Genom att använda hämmare som blockerar aktiviteten av PKC har jag visat att PKC krävs både för att cellerna ska bilda neuriter och uttrycka samma typ av gener som en mogen nervcell. För att kunna undersöka vilken eller vilka PKC-isoformer som behövs för detta, har vi först studerat vilka som uttrycks i neuroblastomcellerna. Vi fann att åtminstone PKC-alfa, PKC-epsilon och PKC-zeta bildas. Både alfa- och epsilon-isoformerna är anrikade i tillväxtkonerna, den struktur i spetsen på en växande neurit som styr neuritutväxten, vilket vi tolkar som att proteinerna är väsentliga i denna process. När en PKC-molekyl aktiveras förändras proteinstrukturen på ett sådant sätt att molekylen lättare bryts ner. En kraftig aktivering av PKC kan alltså leda till att proteinet försvinner från cellen. PKC-alfa är känsligare för nedbrytning än PKC-epsilon i neuroblastomcellerna Därför kan man studera alfa- och epsilon-isoformspecifika effekter genom att använda celler där PKC-alfa är helt nedreglerat men det finns endel PKC-epsilon-protein kvar. Jag har visat att celler som helt saknar PKC-alfa fortfarande kan differentiera då de behandlas med tillväxtfaktorer. Vi drar alltså slutsatsen att det är PKC-epsilon som är den viktiga isoformen vid differentiering. För att ta reda på hur PKC-epsilon-aktiviteten regleras i neuroblastomcellerna har vi letat efter proteiner som binder till PKC-epsilon med hjälp av en s.k. jäst 2-hybridanalys. Vi fann flera kända och okända proteiner som binder till PKC-epsilon och har framför allt studerat ett av dessa, fte-1 (v-fos transformation effektor) som tidigare har visats vara ett protein som sitter i cellens proteinsyntesmaskineri. Fte-1 misstänks också vara inblandat i cancerutvecklingen, förmodligen genom att öka cellernas proteinbildning. I vårt cellsystem visade sig uttrycket av fte-1 minska i differentierande celler. Dessutom hämmades differentieringen i celler där jag ökade mängden fte-1. Cellerna återfick dock förmågan att differentiera om även mängden aktivt PKC-epsilon ökades. Detta kan tyda på att fte-1 hämmar differentiering genom att blockera aktiviteten av PKC-epsilon. I det sista delarbetet har jag studerat signalvägar som aktiveras av PKC. p130cas är ett s.k. dockningsprotein som binder flera andra proteiner när det är fosforylerat. Därmed kan fosforylerat p130cas fungera som en kopplingsstation och integrera flera olika signalvägar. I tidigare arbeten har man framför allt studerat hur p130cas fosforylerats i celler som fäster vid olika underlag. Jag har visat att p130cas blir fosforylerat även i differentierande celler och att PKC-aktivitet krävs för detta. Ökad kunskap om de signalvägar som aktiveras vid neuroblastomcellsdifferentiering skulle kunna användas för att skräddarsy specifika mediciner mot neuroblastom. Om samma signalvägar används även av normala differentierande nervceller skulle i framtiden likartade droger kunna användas för att åstadkomma neuritutväxt efter nervskador.

Subject headings

MEDICIN OCH HÄLSOVETENSKAP  -- Klinisk medicin -- Cancer och onkologi (hsv//swe)

MEDICAL AND HEALTH SCIENCES  -- Clinical Medicine -- Cancer and Oncology (hsv//eng)

Keyword

Neurologi

neurophysiology

neuropsychology

Neurology

p130cas

PKC

fte-1

neuroblastoma

SH-SY5Y cells

growth cones

neuronal differentiation

neuropsykologi

neurofysiologi

Publication and Content Type

dok (subject category)

vet (subject category)