Characterization of folding dynamics and accelerated electron transfer in proteins

• The research presented in this thesis is divided in two: The first part is a study of the intracellular protein human copper zinc superoxide dismutase which has been associated with the fatale disease Amyotrophic lateral Selerosis (ALS). ALS is a progressive neurodegenerative disease of motor neurons, and in the cases where the disease is inheriled (fALS), roughly 15% is caused by mutations in human copper·zinc superoxide dismutase (CuZnSOD). The mechanism by which mutations in SOD1 causes ALS is still unknown, but it is believed that mutant CuZnSOD proteins misfold followed by aggregation into high molecular species that ultimately lead to the death of motor neurons. In our study we have investigated the dynamical and structural differences between the wt of CuZnSOD and the ALS-associated variant G93A. 1H-15N·HSQC NMR spectroscopy was used to analyze hydrogen deuterium exchange at the backbone amide groups. The study showed that the mutation selectively destabilizes the remote metal binding region. This suggests that the metal binding region might be involved in intermolecular protein-protein interactions which may constitule the eariy stages in formation of aggregates. In another of our studies the monomer to dimer equilibrium as weil as the catalytic activity is investigated upon protein denaturation using CdmCI. The study showed persistent dimer interactions and high catalytic activity at GdmCllevels where the holo-protein according to CD measurements is fully unfolded.The second part of this thesis focuses on electron transfer (ET) in proteins. ET processes are fundamental in many biological processes such as respiration and photosynthesis. Biological ET reactions occur rapidly over large molecular distances (>20Å) and only minor structural changes around the active site arises during the ET event. Previous work on Rumodified P. aeruginosa azurin have demonstrated that optimized electron coupling through a θ-strand yield a distance decay constant of 1.1 Å-1. ET in biological systems often requires sub-millisecond charge transport over long molecular distances (>20A). This is not possible via direct tunneling through a θ-strand. It is believed that ET rates can be greatly enhanced by multistep tunneling ("hopping") in which redox-active amino acid side-chains act as intermediate donors or acceptors. In our work, rapid spectroscopic methods are used to investigate hopping through an intermediate tryptophan or tyrosine radical. Cu(l) to Re(II) electron tunneling in Re(H107) azurin occurs in the microsecond range, which is much faster than for previously studied Cu(l) to Ru(III) tunneling in Ru(H107). At first it was believed to be multistep tunneling, but further investigation disproved this. A more likely explanalion is rapid conversion of Re(II)(H107) to deprotonated Re(I)(H107 radieal), followed by electron tunneling from Cu(l) to the hole in the imidazole Iigand. In the other investigated system Cu(l) oxidation by a photoexcited Re(l) diimine at position 124 on a ß-strand (His124-Gly123-Trp122-Met121) takes place in nanoseconds, which is remarkable and more than two orders of magnitude faster than for single-step ET at a 19 Adonoracceptor distance. This system is the first model system to show that an intervening tryptophan residue between donor and acceptor can accelerate the ET rate. Therefore this work was published in Science.

• l denna avhandling presenteras studier på två olika proteiner med viktiga funktioner i den levande cellen. Proteiner är en mycket viktig grupp av makromolekyler som bland annat ombesörjer energiförsörjning, respiration, nedbrytning av slaggprodukter, transport av näringsämnen och andra makromolekyler, nedbrytning av virus och av bakterier med mera. Ett protein består av aminosyror som är sammanlänkade i en lång kedja i en bestämd sekvens. l naturliga proteiner förekommer 20 olika aminosyror med delvis olika kemiska egenskaper. l de allra flesta fallen så är proteinets funktion och tredimensionella struktur helt bestämd av egenskaperna hos dessa aminosyror och den sekvens de har i aminosyrakedjan. De två projekt som här presenteras är typiska exempel på hur viktig den precisa ordningen i aminosyrakedjan är för att proteiner ska få sin rätta struktur och behålla sin funktion i cellen.En studie i denna avhandling har fokus på proteinet koppar,zink-superoxiddismutas (CuZnSOD) som är uppbyggt av två likadana proteinenheter (kallad subenheter) som vidhäftar till varandra. Varje proteinenhet innehåller en koppar- och en zinkjon som är viktiga för proteinets funktion. Om endast en aminosyra i den 153 aminosyror !ånga sekvensen byts ut mot en annan sorts amiansyra så kan det orsaka förändringar i proteinet som leder till den dödliga sjukdomen Amyotroph lateral seleros (ALS). Mer än ett hundra olika sådana utbyten av aminosyror på olika platser i proteinet har kopplats till sjukdomen. En relativt väl underbyggd hypotes är att sjukdomen utvecklas på grund av att det sker strukturella förändringar i proteinet som leder till proteinmolekylerna klumpar ihop sig i aggregat som kan skada cellen. l mina studier har jag med en kombination av gentekniska, biokemiska och biofysikaliska metoder undersökt några av de proteinvarianter som orsakar ALS. l en serie experiment har jag mätt hur rörligheten eller stabiliteten i olika delar av proteinet förändrats i de olika varianterna. Genom att mäta hur snabbt vattenmolekyler i proteinets omgivning kan "tränga in i " proteinet och byta en egen vätejon med en bunden vätejon från proteinet kan man beskriva proteinets stabilitet. Resultaten pekar på att aminosyrautbyten på en plats kan ha sin huvudsakliga effekt på en avlägsen plats i samma proteinmolekyl och mera bestämt att den del av proteinet som binder metallerna tycks bli kraftigt påverkad. Resultaten från andra experiment visar att även gränsområdet mellan de två proteindelarna i vissa fall kan påverkas.Det andra projektet berör elektrontransport inom proteiner. En stor grupp av proteiner i cellen har viktiga funktioner för överföring av energi och transport av elektroner är mycket ofta kopplat till dessa processer. Elektrontransport (ET)över korta avstånd kan ske effektivt via bindningar i proteiner, men vid långa transporter > 20 Å så går den processen för långsamt. l många proteiner måste dock elektronen färdas lång väg och man tror då att den snabbt kan "hoppa" mellan de aromatiska aminosyrorna tryptafan eller tyrosin. Proteinet azurin från Pseudomonas aeruginosa använts som ett modellsystem för studier av ET-reaktioner. l en uppmärksammad studie (publicerad i Science) har vi använt "protein engineering" för att konstruera en snabb väg för elektrontransport och våra resultat visar att en tryptafan som satts in på en plats längs elektronens väg i proteinet accelererade elektrontransporten 1 000-faldigt.

Nyckelord

NATURAL SCIENCES

NATURVETENSKAP

Publikations- och innehållstyp

vet (ämneskategori)

dok (ämneskategori)