Improved bi-allelic modification of a transcriptionally silent locus in patient-derived iPSC by Cas9 nickase

Homology directed repair (HDR)-based genome editing via selectable long flanking arm donors can be hampered by local transgene silencing at transcriptionally silent loci. Here, we report efficient bi-allelic modification of a silent locus in patient-derived hiPSC by using Cas9 nickase and a silencing-resistant donor construct that contains an excisable selection/counter-selection cassette. To identify the most active single guide RNA (sgRNA)/nickase combinations, we employed a lentiviral vector-based reporter assay to determine the HDR efficiencies in cella. Next, we used the most efficient pair of sgRNAs for targeted integration of an improved, silencing-resistant plasmid donor harboring a piggyBac-flanked puro Delta tk cassette. Moreover, we took advantage of a dual-fluorescence selection strategy for bi-allelic targeting and achieved 100% counter-selection efficiency after bi-allelic excision of the selection/counter-selection cassette. Together, we present an improved system for efficient bi-allelic modification of transcriptionally silent loci in human pluripotent stem cells.

Moslem, Mohsen (författare)
Fráguas, Mariane Serra (författare)
Galla, Melanie (författare)
Papp, Oliver (författare)
Naujock, Maximilian (författare)
Fonfara, InesUmeå universitet,Molekylär Infektionsmedicin, Sverige (MIMS),Umeå Centre for Microbial Research (UCMR),Institutionen för molekylärbiologi (Medicinska fakulteten),Max Planck Institute for Infection Biology, Department of Regulation in Infection Biology, Berlin, Germany(Swepub:umu)info0028 (författare)
Gensch, Ingrid (författare)
Wähner, Annabell (författare)
Beh-Pajooh, Abbas (författare)
Mussolino, Claudio (författare)
Tauscher, Marcel (författare)
Steinemann, Doris (författare)
Wegner, Florian (författare)
Petri, Susanne (författare)
Schambach, Axel (författare)
Charpentier, EmmanuelleUmeå universitet,Molekylär Infektionsmedicin, Sverige (MIMS),Umeå Centre for Microbial Research (UCMR),Institutionen för molekylärbiologi (Medicinska fakulteten)(Swepub:umu)emch0006 (författare)
Cathomen, Toni (författare)
Cantz, Tobias (författare)
Umeå universitetMolekylär Infektionsmedicin, Sverige (MIMS) (creator_code:org_t)

Om ämnet

MEDICIN OCH HÄLSOVETENSKAP: MEDICIN OCH HÄLS ...; och Medicinska och f ...; och Mikrobiologi ino ...

Kungliga biblioteket hanterar dina personuppgifter i enlighet med EU:s dataskyddsförordning (2018), GDPR. Läs mer om hur det funkar här.
Så här hanterar KB dina uppgifter vid användning av denna tjänst.