Characterization of ATP-dependent protein dynamics under native-like conditions

• Proteins are biological macromolecules capable of accelerating biochemical reactions. To accomplish this, proteins undergo changes in their molecular structure. Advances in structural biology have resulted in ever-increasing numbers of high-resolution protein structures. However, the majority of transient intermediate states will not amendable with traditional structural determination methods. Therefore, understanding how protein structural changes are correlated with the biological function necessitates development of methods that characterize the reaction in the native environment. P-type ATPase membrane transporters and the adenylate kinase (AK) are two ATP-dependent proteins that undergo extensive conformational change in their reaction cycles. While P-type ATPases maintain concentration gradients of ions across the cellular membranes, AK regulates cellular energy homeostasis by catalyzing interconversion of nucleotides. Resolving P-type ATPase and AK temporal and spatial structural dynamics is crucial to understand how these proteins are triggered by ATP for functionality. To pave way for time-resolved X-ray characterization of ATP-dependent conformational changes, it was necessary to identify optimal conditions for triggering protein reactions. Therefore, time-dependent Fourier-Transform Infra-Red (FTIR) spectroscopy of a recombinant Zn2+-transporting ATPase was used to optimize activation by photolysis of caged ATP. These conditions were then used to track structural dynamics of the Ca2+-transporting sarcoplasmic reticulum ATPase (SERCA) in skeletal muscle native membranes. Fast single-cycle dynamics were registered with the formation of an intermediate state at 1.5 ms followed by steady-state accumulation at 13 ms. The molecular dynamic (MD)-based structural refinement procedure showed that the 13-ms transient intermediate represented an ADP-sensitive, phosphorylated Ca2+-bound E1 state (Ca2E1P), with a domain arrangement that has so far eluded structural characterization.MD simulations of the identified SERCA transient intermediates further finetuned their positions in the reaction cycle. The 1.5-ms state was assigned to an ATP-bound state prior to phosphorylation, while the 13-ms state was stable in its Ca2E1P conformation. Because the simulations were performed in multicomponent lipid bilayers mimicking the native membrane, specific state-dependent lipid interactions were also identified. Finally, the wider applicability of the time-resolved X-ray method to study ATP-dependent protein dynamics was demonstrated by tracking AK structural dynamics. A transient intermediate at 5 ms was identified that showed closing of the ATP-binding domain prior to the NMP-binding domain, in the presence of both ATP and AMP substrates. This study provided conclusive experimental proof of the relative ordering of domain closure that had been predicted by several computational studies.In summary, the work presented in this thesis has contributed to developing the time-resolved X-ray method to study the structural dynamics of ATP-dependent proteins.

• Populärvetenskaplig sammanfattningProteiner är biologiska makromolekyler vars arbetsuppgifter i cellen möjliggör liv. Föratt kunna utföra sina tillordnade funktioner måste proteinets struktur i många fallförändras. Denna inneboende dynamik är inkodad i proteinets aminosyrasekvens ochhar optimerats genom evolutionsprocessen. I många fall finns det molekyler som kanstarta igång ett visst proteins funktion. En sådan molekyl är adenosintrifosfat (ATP)som är en organisk förening som tillhandahåller energi till ATP-beroende proteiner.Ett exempel är P-typs ATPaser som är proteiner insprängda i cellens membran somtransporterar olika joner. Denna transport möjliggörs av proteinets strukturellaförändringar som sätts igång av energi tillförd av ATP molekylen. Även proteinet somreglerar tillgången av ATP i cellen genomgår stora konformationsförändringar. Dettaprotein är adenylatkinas (AK) och katalyserar interkonversion av nukleotider. För attförstå hur dessa proteiner kan startas igång av ATP molekylen är det därför viktigt attbestämma hur deras strukturer förändras över tid till följd av tillgång på ATP.För P-typs ATPaser har ett stort antal strukturer av olika intermediära tillståndbestämts främst genom röntgenkristallografi. Dock så kommer det finnas instabilatillstånd som aldrig kommer att kunna fångas av traditionellastrukturbestämningsmetoder. Utöver detta så är det möjligt att proteinet inte kangenomgå sina naturliga strukturförändringar i en proteinkristall. För ettmembranprotein är dessutom funktionen beroende av dess omgivande lipidmembran.För att bättre förstå proteinets funktion är det därför viktigt att försöka studera denaktuella processen under förhållanden så nära som möjligt till de fysiologiskaförhållandena som råder i cellen.Denna avhandling syftade till att vidareutveckla en existerande tidsupplöströntgenspridningsteknik (TR-XSS) för att karakterisera ATP-beroendeproteindynamik i lösning. För att erhålla en tillräckligt stark signal i dessa experimentmåste en stor del av proteinerna i provet utföra sin funktion samtidigt. Detta kanuppnås genom laseraktivering. Vi använde laseraktivering av en burförening av inaktivATP för att starta transportreaktionen för en zinktransportör från den patogenabakterien Shigella sonnei. Genom att följa signalen från ATP hydrolys med infrarödspektroskopi hittades lämpliga betingelser för TR-XSS synkrotronexperiment.Förutom att bana vägen för tidsupplösta röntgenförsök är kinetiken ochstrukturdynamiken av intresse eftersom denna zinktransportör är vanligtförekommande hos patogena bakterier men inte hos människor och därför utgör ettpotentiellt målprotein för utveckling av nya antibiotika.Vid utvecklingen av TR-XSS-metoden användes laseraktivering av en ATP burföreningför att studera en strukturellt väl-karakteriserad kalciumtransportör (SERCA) i dessnaturliga membranmiljö istället för i proteinkristaller. Experimenten identifierade ettintermediärt tillstånd vid 1.5 millisekunder och ackumuleringen av ett annat hastighetsbegränsande intermediärt tillstånd vid 13 millisekunder. Med hjälp avmolekyldynamikdatorsimuleringar (MD) bestämdes sedan strukturen av dethastighetsbegränsande tillståndet i en konformation som ännu inte hade observeratsmed traditionella strukturbestämningsmetoder. MD-simulering avstrukturmodellerna erhållna från TR-XSS-metoden i membranmodeller somimiterade den naturliga lipidsammansättningen finjusterade placeringen av debestämda tillstånden i SERCA-reaktionscykeln samt karakteriserade deras interaktionmed de omgivande lipiderna.Den utvecklade TR-XSS-metoden användes sedan för att studera ATP-beroendeproteindynamik för AK. Resultaten visade experimentellt den relativa ordningen på destrukturella förändringar som proteinet genomgår som respons på ATP tillgång. Dettavisar på bredden hos den utvecklade röntgenmetoden. Dessutom finns flera olika typerav burföreningar tillgängliga, såsom metaboliter, joner, och signalsubstanser, vilketytterligare öppnar upp för möjliga målproteiner.

Ämnesord

NATURVETENSKAP  -- Biologi -- Biofysik (hsv//swe)

NATURAL SCIENCES  -- Biological Sciences -- Biophysics (hsv//eng)

Nyckelord

proteins

membrane proteins

structural dynamics

ATPases

MD simulations

X-ray scattering

FTIR spectroscopy

ATP

TR-XSS

structural biology.

Biochemistry

biokemi

Publikations- och innehållstyp

vet (ämneskategori)

dok (ämneskategori)