Protein adducts of hexahydrophthalic anhydride- chemical structures and biomarkers

• Organic acid anhydrides (OAAs) are low molecular weight chemicals used in the industry for manufacturing of plastics such as epoxy resins. Exposure to these chemicals may lead to symptoms from the eyes and the respiratory tract in form of conjunctivitis, rhinitis and asthma. In many workers production of specific IgE antibodies are induced suggesting that a type-1 allergy mediated mechanism is involved. The OAAs act as haptens and the binding to endogenous proteins is probably an important part of the pathophysiological mechanism. The aim of this thesis was to identify potentially allergenic chemical structures using hexahydrophthalic anhydride (HHPA), a highly sensitising OAA, as a model substance. The aim was also to develop a new method for biological monitoring of HHPA. The binding of HHPA to several nucleophilic amino acids and a model peptide was initially studied. Stable adducts to lysine and the N-terminal amino group were found. Unstable adducts to cysteine, histidine, tyrosine and tryptophan were also identified. The cysteine adduct could be transferred to lysine residues. Studies of potential allergenic structures were performed on hapten-protein conjugates between HHPA and hemoglobin (Hb) and human serum albumin (HSA), respectively, synthesised in vitro. Enzyme digestions of the conjugates were performed and the binding sites of HHPA were identified through analysis of the peptides using liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry. HHPA adducts were found with several lysine residues and the N-terminal amino group both in Hb and HSA. Further studies must be performed to determine the allergenic potential of these identified adducts. Based on the identifications of the binding sites of HHPA to HSA a method was developed to measure HHPA-adducted tryptic peptides of HSA in nasal lavage samples. The nasal lavages were obtained from five volunteers exposed to HHPA at different air concentrations of HHPA. The major binding sites of HHPA found in the in vitro studies were detected in the in vivo samples as well. The levels of these adducted peptides were highly correlated with the air levels of HHPA on an individual basis but there were large inter-individual differences. Thus, it should be investigated whether these peptides may be used as biomarkers of effective dose, which then would better reflect the risk than more traditional biomarkers.

• Popular Abstract in Swedish Organiska syraanhydrider (OSA) är reaktiva kemikalier med låg molekylvikt som används industriellt vid produktion av olika plaster, främst så kallade polyestrar och epoxiplaster. Där används de bland annat för att tvärbinda polymerer, det vill säga molekyler bestående av långa kedjor där små enheter av samma struktur upprepas. Det har visat sig att personer som exponeras för de organiska syraanhydriderna under tillverkningsprocessen i många fall utvecklar besvär från ögon, näsa och lungor i form av ögoninflammation, hösnuva och i vissa fall astma. Mekanismerna som liggare bakom uppkomsten av dessa symptom är fortfarande till stor del okända. Dock har tidigare studier visat att immunoglobulin E (IgE) antikroppar specifika för anhydriden förekommer i blodet hos en del arbetare med symptom. I de fall där IgE antikropparna påträffas betyder det att symptomen kan orsakas av en så kallad allergisk typ-1 reaktion. Lågmolekylära ämnen som OSA är för små för att själva utlösa immunologiska reaktioner. Det är därför troligt att ett viktig steg i processen sker då anhydriden reagerar med kroppsegna proteiner. Den nya förändrade strukturen känns igen av kroppen som främmande som svarar med att producera antikroppar till försvar. På grund av sina allergiframkallande egenskaper kan man med fördel använda OSA som modellsubstanser för att studera kemiska strukturer som ger upphov till allergi. Dessa strukturer är viktiga att studera som en del i att utöka förståelsen för de bakomliggande mekanismerna till allergins uppkomst samt för att använda som grund för metoder att mäta exponering för dessa ämnen. I den här avhandlingen har en mycket allergiframkallande anhydrid, hexahydroftalsyraanhydrid (HHPA), studerats. I det första skedet studerades reaktioner mellan HHPA och utvalda aminosyror, vilka är byggstenar i proteinerna, med förmåga att reagera med anhydrider för att få kunskap om vilka så kallade addukter som bildas samt deras stabilitet. Reaktionerna studerades vid olika pH-värden som skulle representera hudens pH samt blodets pH. Vidare i avhandlingen studerades strukturförändringar hos två olika proteiner, hemoglobin i de röda blodkropparna och humant serum albumin (HSA), som uppstår vid reaktion med anhydriden. Hemoglobinet valdes som ett modellprotein för metodutveckling och HSA valdes eftersom tidigare försök har visat att modifiering av just det proteinet gör det immunologiskt relevant. Strukturförändringarna studerades genom att kartlägga inbindningen av HHPA till proteinernas primärstruktur det vill säga aminosyrasekvensen hos proteinet i fråga. Studierna har genomförts på konjugat mellan HHPA och protein som syntetiserats i buffertlösning vid pH 7.4. Det visade sig att hos hemoglobinet band HHPA i första hand in till aminogruppen i början på proteinkedjan, samt till flera lysiner. I HSA kunde tre olika lysiner identifieras som band HHPA i högre grad. Fortsatta studier kommer att genomföras för att undersöka de allergena egenskaperna hos just dessa strukturer. Det är också viktigt att ta fram metoder för att mäta exponering samt för att ta fram så kallade dos-responssamband, det vill säga information om vid vilken exponering som sjukdom uppstår. I vissa fall kan ämnen som tagits upp i kroppen och brutits ner eller bundit in till andra ämnen användas som biomarkörer, som ett mått på om och i vilken utsträckningen person har utsatts för ett visst ämne. I avhandlingen utvärderas en metod baserad på resultaten från karakteriseringen av inbindningen av HHPA till HSA. Näsan hos försökspersoner utsatta för HHPA sköljdes med koksaltlösning och ur denna lösning spjälkades HSA ner till peptider, det vill säga mindre delar av proteinet. Peptider som i de tidigare försöken visats binda HHPA valdes ut för analys. Halterna av dessa peptider överensstämde väl med lufthalterna av HHPA och peptiderna kan användas för att mäta exponeringen.

Ämnesord

MEDICIN OCH HÄLSOVETENSKAP  -- Hälsovetenskap -- Arbetsmedicin och miljömedicin (hsv//swe)

MEDICAL AND HEALTH SCIENCES  -- Health Sciences -- Occupational Health and Environmental Health (hsv//eng)

Nyckelord

arbetsmiljömedicin

Yrkesmedicin

industrial medicine

Occupational health

nasal lavage

mass spectrometry

biomarker

human serum albumin

hemoglobin

Hexahydrophthalic anhydride

adducts

Publikations- och innehållstyp

dok (ämneskategori)

vet (ämneskategori)