The CD40 Receptor - Target,Tool and Technology

• CD40 is a cell surface receptor of pivotal importance that is expressed on several of the cells in the immune system. It is critical for many important events, such as T cell dependent B cell activation, isotype switching, somatic mutation and generation of B cell memory. The central role of CD40 in the immune system makes it an ideal target for antibody based immunotherapy. This led us to characterise a panel of monoclonal anti-CD40 antibodies. In PAPER I, we investigated their cellular activation potential and analysed to what extent this correlates with their affinity, epitope specificity and domain recognition profile. The antibody profiles we obtained in this first study may be valuable for understanding of the mechanisms that influence the therapeutic capacity of these antibodies. In fact, one of the antibodies that we investigated is currently in phase I/II trials. However, all of the antibodies that we characterised in PAPER I are of mouse origin, which probably limits their clinical efficiency, due to the human anti-mouse response that most patients develop against such antibodies. Therefore we selected a set of human anti-CD40 antibodies, which are described in PAPER II, from a recombinant antibody gene library. These antibodies display a wide variety of distinct properties, which may make them a valuable source when evaluating therapeutic candidates for in vivo trials. In PAPER III, we have used some of the anti-CD40 antibodies described in PAPER II to create an antibody library that was utilised to investigate antibody evolution in vitro. The results from this study showed that events, which resembles receptor revision, i.e. secondary rearrangements of antibody genes in the periphery, may provide an evolving antibody with competitive advantages during a selection process that is similar to the affinity maturation process in vivo. Our data reinforce the suggestion that receptor revision is an important complement to point mutations and insertions and deletions in the somatic hypermutation process that occur in germinal centres. It has been suggested that members of the TNFR family pre-associate in the membrane via one of the extracellular domains, the pre-ligand assembly domain (PLAD). Therefore, in PAPER IV, we investigated the functional role of the different domains of CD40, in a B cell model system. The results from this study showed that neither of the extracellular domains is essential for signal transduction and, furthermore, implies that conformational changes play no critical role for the CD40 signalling pathway. Based on the findings that all of the extracellular part of CD40 can be replaced with retained signalling capacity, we developed a novel selection method, named Selection of Protein Interactions by Receptor Engagement (SPIRE). In PAPER V, we demonstrated that this selection system can be used for clonal enrichment of cells that display a mock-CD40 receptor, used as prey, on the surface by interaction with a certain bait protein. Thus, SPIRE allows for clonal selection of interacting protein pairs in a mammalian environment. SPIRE may have several different applications such as identification of tumour antigens or for molecular evolution of complex proteins.

• Popular Abstract in Swedish Vårt immunförsvar arbetar konstant med att skydda kroppen från olika föremål, t. ex. bakterier, virus, gifter och cancertumörer, som kan orsaka skada eller sjukdom. För att kunna försvara kroppen mot sådana föremål så har immunförsvaret tillgång till flera, oerhört effektiva, vapen. Det viktigt att immunförsvaret känner igen, och endast angriper, skadliga föremål, så att inte dessa vapen attackerar de normala cellerna och vävnaderna i kroppen. För att immunförsvarets olika beståndsdelar skall kunna bestämma om, och hur, dom skall reagera på exempelvis ett virus, krävs det att de olika cellerna i immunsystemet kommunicerar med varandra. Denna kommunikation sker bland annat via receptorer som finns på cellernas yta. En av immunförsvarets viktigaste receptorer kallas CD40, och den återfinns på flera av de celler som ingår i vårt immunsystem. I den här avhandlingen sammanfattas ett antal studier, där CD40 använts och undersökts, dels som målmolekyl för att ta fram och studera nya antikroppar, dels som verktyg för att studera en immunologisk process, och slutligen för att utveckla en ny biomedicinsk teknologi. I den första artikeln har vi undersökt ett antal antikroppar som binder till CD40. Anledning till att sådana antikroppar är intressanta, är att de skulle kunna användas som ett framtida läkemedel för behandling av exempelvis olika cancerformer och av multipel skleros (MS). De antikropparna vi undersökte i den första studien var ursprungligen framtagna från en mus. Detta innebär att det mänskliga immunförsvaret ”ser” dessa antikroppar som något främmande, och tror därför att de kan vara skadliga. Därmed kommer immunförsvaret att snabbt göra sig av med antikropparna, vilket gör dem olämpliga för utveckling av nya behandlingsmetoder för människor. Emellertid kunde de kunskaper om antikroppar mot CD40 som vi fick från den första studien användas i den andra studien, där vi, med hjälp av moderna biotekniska metoder, tog fram ”mänskliga” antikroppar. I och med att dessa antikroppar är ”mänskliga”, så kommer vårt immunförsvar att, med stor sannolikhet, inte se dem som något främmande, utan accepterar dem som kroppsegna antikroppar. Vidare så visade vi i den artikeln att dessa nya antikroppar har intressanta egenskaper som kan visa sig vara värdefulla för utveckling av framtida läkemedel. De antikroppar som vi tagit fram i den andra artikeln, användes i den tredje studien för att undersöka de processer som är involverade i antikroppsutveckling i kroppen. Vi använde oss då av en teknik som liknar den normala antikroppsutvecklingen i kroppen. De data som framkom från den studien, visar att det i vissa fall är fördelaktigt för utvecklingen av en antikropp att stora delar av den gen som beskriver hur antikroppen skall se ut byts ut mot ett annat, liknande gensegment. Våra resultat stödjer därmed den teori som föreslår att sådana förändringar av antikroppsgener är en viktig del av utvecklingen av antikroppar i vår kropp. I den fjärde studien undersökte vi hur de delar av CD40 som finns på utsidan av cellerna påverkar dess funktion som receptor. Anledningen till at vi intresserade oss för det var att en del grupper har föreslagit att en dessa delar är viktig för kommunikationen genom CD40 in i cellen. Våra data visade att man kan ta bort i princip alla de yttre delarna av CD40 receptorn och ändå skicka signaler via den, om man bara ersätter dem med ett litet igenkänningsfragment. I den sista artikeln beskriver vi utvecklingen av en ny biomedicinsk teknik som vi kallat för SPIRE. Förkortningen står för Selection of Protein Interactions by Receptor Engagement som kan översättas med ”Selektion av proteininteraktioner genom receptor engagemang”. I den studien utnyttjade vi resultaten från den fjärde studien som visade att de yttre delarna av CD40 kan ersättas. I SPIRE byts den yttre delen av CD40 mot ett stort ”bibliotek” av olika, okända, molekyler, som därmed kan fungera som ”låtsasreceptorer”. Från detta bibliotek kan man sedan selektera fram de celler som har en viss låtsasreceptor på ytan. SPIRE-tekniken kan komma att få ett brett användningsområde, exempelvis för att utvecklingen av nya läkemedel.

Ämnesord

MEDICIN OCH HÄLSOVETENSKAP  -- Medicinska och farmaceutiska grundvetenskaper -- Immunologi inom det medicinska området (hsv//swe)

MEDICAL AND HEALTH SCIENCES  -- Basic Medicine -- Immunology in the medical area (hsv//eng)

Nyckelord

Immunology

serology

transplantation

Immunologi

serologi

SPIRE

mammalian

library

cDNA

selection

receptor revision

phage display

scFv

human

CD40

antibodies

Publikations- och innehållstyp

dok (ämneskategori)

vet (ämneskategori)