Targeting HER2-expressing tumors with potent drug conjugates and fusion toxins based on scaffold proteins

• Targeted therapy is an emerging treatment for a variety of cancers. Small- sized scaffold proteins are an alternative to conventional antibody-based targeting molecules. Two small scaffold proteins—the 58-amino-acid protein class, the affibody molecules, and the 46-amino-acid protein class, the Albumin binding domain Derived Affinity Proteins (ADAPTs)—have previously been engineered to bind to a large variety of tumor-associated molecular targets with a high affinity. The human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) is a membrane-bound receptor for growth signal transmission. Expression of a high level of HER2 can cause cells to proliferate and may ultimately lead to cancer. It has earlier been shown that HER2 is involved in several different types of cancers, e.g., breast, ovarian, bladder, and gastric cancers. HER2-targeted affibody and ADAPT molecules have previously been developed, such as ZHER2:2891 and ADAPT6 with strong affinity to HER2 with equilibrium dissociation constants of 76 pM and 2.5 nM, respectively. Their small size and high specificity have rendered these two scaffold proteins promising candidates for imaging of HER2-positive breast cancer tumors in clinical trials. Delivery of cytotoxic agents to cancer cells, using a cell-targeting domain, may potentially precisely kill the cancer cells while having very low cytotoxic effects on normal cells. Many cancer-targeted antibody drug conjugates (ADCs) and toxic proteins (immunotoxins) have advanced the field of cancer treatment. Small-sized scaffold proteins hold promise as alternative targeting domains to build novel drug conjugates or fusion toxins for cancer treatment. In this thesis, I first investigated an affibody-based drug conjugate (AffiDC) composed of an anti-HER2 affibody and an anti-mitotic maytansine-derived drug (DM1) for treatment of HER2-overexpressing cells. I studied a variety of targeting domain formats for efficacy optimization. All ZHER2:2891-based AffiDCs showed specific anti-tumor activity on HER2-overexpressing cancer cells in vitro as well as in mouse tumor xenografts. The hepatic uptake of the AffiDCs could be reduced by shielding the hydrophobic DM1 using a poly-glutamic-acid spacer, which might help to reduce potential liver toxicity allowing for administration of higher doses. In addition, tuning the valency of the affibody-targeting domain (ZHER2) from a divalent domain to a monovalent domain showed increased potency and reduced liver uptake. We also investigated the influence of the number of drug payloads on the pharmacokinetic profile of the AffiDCs. An AffiDC bearing three DM1s showed higher delivery of DM1 to the cancer cells in vivo, but fast blood clearance and an elevated liver retention was also observed. With regards to fusion toxin design, we constructed a variety of recombinant toxins. The targeting domains were ZHER2:2891 and/or ADAPT6, which were genetically fused with truncated versions of the highly cytotoxic Pseudomonas Exotoxin A (PE). All fusion toxins we studied showed potent HER2-specific anti-tumor activity. The results suggested that both ZHER2:2891 and ADAPT6 could direct the PE-based cytotoxins specifically to HER2- overexpressing cancer cells. In this work, we have demonstrated the potential of using ZHER2:2891 and ADAPT6 as targeting domains to carry the small molecule drug DM1, or cytotoxic PE-derived peptides to cancer cells. It can be concluded that careful molecular design of the targeting domain may considerably improve the potency and minimize the off-target uptake. 

• Riktad terapi är en framväxande behandlingsmetod för en mängd olika cancerformer. Små affinitetsproteiner är ett alternativ till konventionella antikroppsbaserade målsökarmolekyler. Två små affinitetsproteiner – de 58-aminosyror stora affibodymolekylerna och de 46 aminosyror stora Albumin binding domain derived affinity proteins (ADAPTs) – har tidigare genererats för att binda till en stor mängd olika tumörassocierade molekylära målmolekyler med hög affinitet.Human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) är en membranbunden receptor för överföring av tillväxtsignaler. Uttryck av en hög nivå av HER2 kan få celler att dela sig och kan i slutändan leda till cancer. Det har tidigare visats att HER2 är involverat i flera olika typer av cancer, t.ex. bröst-, äggstocks-, urinblåse- och magcancer.HER2-riktade affibodymolekyler och ADAPT-molekyler har tidigare utvecklats, t.ex. ZHER2:2891 och ADAPT6, med stark affinitet till HER2 med jämviktsdissociationskonstanter på 76 pM respektive 2,5 nM. Deras ringa storlek och höga specificitet har gjort dessa två affinitetsproteiner till lovande kandidater för avbildning av HER2-positiva bröstcancertumörer i kliniska prövningar.Leverans av cytotoxiska läkemedel till cancerceller, med användning av en målsökande domän, kan potentiellt döda cancercellerna samtidigt som de har en låg cytotoxisk effekt på normala celler. Många cancerriktade antikroppsläkemedelskonjugat (ADCer) och toxiska proteiner (immunotoxiner) har expanderat cancerbehandlingsmöjligheterna. Små affinitetsproteiner är lovande som alternativa målsökarmolekyler för att bygga nya läkemedelskonjugat eller immunotoxiner för cancerbehandling.I denna avhandling undersökte jag först ett affibodybaserat läkemedelskonjugat (AffiDC) bestående av en anti-HER2 affibodymolekyl och ett antimitotiskt maytansinoid-derivat (DM1) för behandling av HER2-överuttryckande celler. Jag studerade en mängd olika format för den målsökande domänen för optimering av effektiviteten. Alla ZHER2:2891-baserade AffiDCer visade specifik antitumöraktivitet mot HER2-överuttryckande cancerceller in vitro, såväl som i transplanterade tumörer i möss. Leverupptaget av AffiDCerna kunde minskas genom att skydda den hydrofoba DM1-delen med en poly-glutaminsyra-linker, vilket kunde bidra till att minska potentiell levertoxicitet vilket möjliggör administrering av högre doser. Dessutom visade justering av valensen för den målsökande affibodydomänen (ZHER2) från en divalent domän till en monovalent domän ökad potens och minskat leverupptag. Vi undersökte också påverkan av antalet läkemedelsmolekyler på AffiDCernas farmakokinetiska profil. En AffiDC som bär tre DM1 visade högre leverans av DM1 till cancercellerna in vivo, men en kort halveringstid i blod och ett förhöjt leverupptag observerades samtidigt.När det gäller design av fusionstoxiner, konstruerade vi en mängd olika rekombinanta toxiner. Måldomänerna var ZHER2:2891 och/eller ADAPT6, som var genetiskt fuserade med trunkerade versioner av den starkt cytotoxiska peptiden Pseudomonas Exotoxin A (PE). Alla fusionstoxiner vi studerade visade potent HER2-specifik antitumöraktivitet. Resultaten antydde att både ZHER2:2891 och ADAPT6 kunde leverera de PE-baserade cellgifterna specifikt till HER2-överuttryckande cancerceller.I detta arbete har vi visat potentialen i att använda ZHER2:2891 och ADAPT6 som målsökande domäner för att bära det småmolekylära läkemedlet DM1, eller cytotoxiska PE-deriverade peptider till cancerceller. Man kan dra slutsatsen att noggrann molekylär design av målsökardomänen kan förbättra potensen avsevärt och minimera upptaget i normal vävnad.

Ämnesord

NATURVETENSKAP  -- Biologi -- Biokemi och molekylärbiologi (hsv//swe)

NATURAL SCIENCES  -- Biological Sciences -- Biochemistry and Molecular Biology (hsv//eng)

Nyckelord

Targeted therapy

affibody molecules

ADAPT molecules

AffiDC

fusion toxins

HER2

Biotechnology

Bioteknologi

Publikations- och innehållstyp

vet (ämneskategori)

dok (ämneskategori)