Engineering enzymes towards biotherapeutic applications using ancestral sequence reconstruction

• Enzymes are versatile biocatalysts that fulfill essential functions in all forms of life and, therefore, play an important role in health and disease. One specific application of enzymes in life science is their use as biopharmaceuticals, which typically benefits from high catalytic activity and stability. Increased stability and activity are both desirable properties for biopharmaceuticals as they are directly related to dosage, which in turn affects administration time, cost of production and potency of a drug. The aim of the work presented in this thesis is to enhance the therapeutic potential of enzymes by means of enzyme engineering, in particular using ancestral sequence reconstruction. In Paper I, we established the utility of this method in a model system and obtained ancestral terpene cyclases with increased activity, stability and substrate scope. In Paper II, we described the successful crystallization of the most stable ancestral terpene cyclase, which allowed for rational design of substrate specificity. Finally, we applied the method to two therapeutically relevant enzyme families associated with rare metabolic disorders. We obtained ancestral phenylalanine/tyrosine ammonia-lyases with substantially enhanced thermostability and long-term stability in Paper III and ancestral iduronate-2-sulfatases with increased activity in Paper IV. In summary, the results presented herein highlight the potential of ancestral sequence reconstruction as a method to obtain stable enzyme scaffolds for further engineering and to enhance therapeutic properties of enzymes.

• Enzymer är mångsidiga biokatalysatorer som uppfyller väsentliga funktioner i alla livsformer och därför är viktiga när det kommer till hälsa och sjukdom. En specifik tillämpning av enzymer inom hälsovetenskap är deras användning som bio-baserade läkemedel, vilket vanligtvis drar nytta av hög katalytisk aktivitet och stabilitet. Ökad stabilitet och aktivitet är båda önskvärda egenskaper för biofarmaceutiska läkemedel eftersom de är direkt relaterade till dosering, vilket i sin tur påverkar administreringstid, produktionskostnad och terapeutisk effekt. Syftet med arbetet som presenteras i denna avhandling är att förbättra den terapeutiska potentialen hos enzymer med hjälp av enzymteknik, särskilt genom rekonstruktion av förfädersenzymer. I Artikel I testade vi användbarheten av denna metod i ett modellsystem och erhöll ancestrala terpencyklaser med ökad aktivitet, stabilitet och substratacceptans. I Artikel II beskrev vi kristalliseringen av det mest stabila förfädersenzymet, vilket möjliggjorde rationell modifiering av substratspecificitet. Till slut använde vi metoden på två terapeutiskt relevanta enzymfamiljer som båda är associerade med sällsynta ämnesomsättningssjukdomar. Vi erhöll ancestrala fenylalanin/tyrosin ammonia-lyaser med väsentligt förbättrad termostabilitet och långvarig stabilitet i Artikel III och ancestrala iduronat-2-sulfataser med ökad aktivitet i Artikel IV. Sammanfattningsvis belyser resultaten i denna avhandling potentialen av metoden för att erhålla stabila modellenzymer för ytterligare modifiering och för att förbättra terapeutiska egenskaper hos enzymer.

Ämnesord

TEKNIK OCH TEKNOLOGIER  -- Kemiteknik (hsv//swe)

ENGINEERING AND TECHNOLOGY  -- Chemical Engineering (hsv//eng)

NATURVETENSKAP  -- Biologi -- Biokemi och molekylärbiologi (hsv//swe)

NATURAL SCIENCES  -- Biological Sciences -- Biochemistry and Molecular Biology (hsv//eng)

NATURVETENSKAP  -- Data- och informationsvetenskap -- Bioinformatik (hsv//swe)

NATURAL SCIENCES  -- Computer and Information Sciences -- Bioinformatics (hsv//eng)

Nyckelord

enzyme engineering

enzyme evolution

ancestral sequence reconstruction

therapeutic enzymes

terpene cyclases

ammonia-lyases

sulfatases

lysosomal enzymes

Kemi

Chemistry

Publikations- och innehållstyp

vet (ämneskategori)

dok (ämneskategori)